CRITIC-AHP法结合Box-Behnken响应面法优选三金排石合剂提取工艺

2022-09-13石金敏周灿余绪明钟鑫昊王佳赵利军十堰市人民医院湖北医药学院附属人民医院药学部湖北十堰442000华中农业大学植物科学技术学院武汉40070湖北医药学院药学院湖北十堰442000

中南药学 2022年6期

石金敏，周灿，余绪明，钟鑫昊，王佳，赵利军*（.十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院）药学部，湖北十堰 442000；2.华中农业大学植物科学技术学院，武汉 40070；.湖北医药学院药学院，湖北十堰 442000）

三金排石合剂由石韦、金钱草、鸡内金、瞿麦、川牛膝、乌药、白芍、通草、海金沙和甘草等十味药材配伍组成，诸药合用，共奏清热利湿、通淋排石、活血通经、祛瘀止痛之效。对于湿热下注膀胱，煎熬尿液结为砂石，导致小便不利或中断，尿血，肾结石，尿道炎等泌尿系疾病具有良好的治疗效果，疗效确切，应用广泛，但未对其制备工艺进行系统的研究，本试验以槲皮素、山柰酚和干膏得率等指标的含量进行CRITIC-AHP 法综合评分，基于Box-Behnken 设计-响应面法得到三金排石合剂的提取工艺，以期为其深入研究及开发利用提供数据支持，保证临床用药的安全有效。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KGD-15L 超声波清洗仪（科广达超声设备有限公司）；CP214 电子分析天平（奥豪斯公司）。

1.2 试药

石韦、金钱草等药材均购自十堰市人民医院，经药学部雷龙副主任中药师鉴定均符合《中国药典》2020年版相关规定。

对照品山柰酚（批号：110861-202013，含量93.2%）、槲皮素（批号：100081-201610，含量99.1%）（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；无水乙醇、盐酸、磷酸（分析纯，武汉市中天化工有限责任公司）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 样品制备

精密称量三金排石合剂方中对应的中药饮片共40.3 g，选取1000 mL 圆底烧瓶，将药材分别加入烧瓶中，按照响应面法设计条件进行回流提取，收集每一次的提取液并浓缩至100 mL 以下，用水定容至100 mL 量瓶中。

2.2 色谱条件

色谱柱：WondaSiL C-WR 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸水（43∶57）；流速：1.00 mL·min；检测波长：360 nm；柱温：40℃；进样量：10 μL。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取槲皮素、山柰酚对照品适量，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为7 μg·mL、10 μg·mL的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

精密吸取样品10 mL，置于100 mL 锥形瓶中，精密加入40 mL 甲醇和6 mL 盐酸，称重，90℃水浴回流提取1 h，迅速冷却，加80%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 系统适应性试验取“2.3”项下对照品溶液，“2.4”项下供试品溶液，空白溶液（精密吸取纯净水10 mL，同“2.4”项下方法制备），进样检测，色谱图见图1。

图1 三金排石合剂HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of Sanjin Paishi mixture

2.5.2 线性关系考察分别精密称取槲皮素、山柰酚对照品适量，用甲醇稀释成质量浓度槲皮素为28、14、7、3.5、1.8、0.9 μg·mL和山柰酚为42、21、11、5.5、2.8、1.4 μg·mL的混合对照品溶液，进样测定，以各成分的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，槲皮素、山柰酚线性回归方程分别为

＝4×10

－3783.5（

＝1.0000），

＝4.8×10

－1.41×10（

＝0.9998），线性范围分别为0.9 ～28 μg·mL和1.4 ～42 μg·mL。2.5.3 精密度试验精密吸取同一对照品溶液，连续进样6 次，结果槲皮素、山柰酚峰面积的

RSD

值分别为2.1%、1.3%，结果表明仪器精密度较好。2.5.4 重复性试验取“2.4”项下供试品溶液6 份，进样测定，计算得槲皮素、山柰酚峰面积的

RSD

值分别为3.5%、3.5%，表明该方法的重复性较好。2.5.5 稳定性试验取“2.4”项下同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h 进样测定，结果槲皮素、山柰酚峰面积的

RSD

值分别为2.0%、1.5%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。2.5.6 加样回收试验分别精密量取“2.1”项下已知含量的样品5 mL 6 份，分别加入0.02 mg·mL槲皮素对照品溶液和0.035 mg·mL山柰酚对照品溶液适量，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，进样检测，计算槲皮素、山柰酚平均加样回收率分别为98.6%和100.1%，

RSD

依次为2.6%和4.0%，结果表明该方法准确度良好。

2.6 干膏得率测定[2]

精密量取“2.1”项下样品溶液25 mL，置于已干燥至恒重的陶瓷蒸发皿中，水浴蒸干，再置于恒温鼓风干燥箱内105 ℃恒温干燥3 h，冷却至室温，迅速称定重量，计算干膏得率。

2.7 综合评分

2.7.1 CRITIC 法计算权重将方差分析的试验数据经过线性插值处理，即[指标成分值＝（实测值－最小值）／（最大值－最小值）]，消除单位量纲后，计算各指标对比强度（

）、冲突性（

）、综合权重（

）与权重（

），结果见表1。由表1 可知，槲皮素、山柰酚、干膏得率经CRITIC 法计算得到的客观权重分别为0.2504、0.2460、0.5036。

表1 CRITIC 法各指标数值
Tab 1 Index values of CRITIC method

考察指标槲皮素山柰酚干膏得率si23.733423.362327.8561 δi 0.5340 0.5330 0.9150 ci12.673612.452125.4883 ωi 0.2504 0.2460 0.5036

2.7.2 AHP 法计算权重根据方中各成分的药理作用强弱和君臣佐使配伍规律，将干膏得率和指标性成分的重要性作为权重指标予以指标量化，构建成对比较的判断优先矩阵，各指标的优先顺序：槲皮素＝山柰酚＞干膏得率，赋予各项指标的相对评分，经层次分析后的结果见表2。

表2 指标成对比较优先判断矩阵
Tab 2 Priority judgment matrix for paired comparison of indicators

指标成分槲皮素山柰酚干膏得率槲皮素114山柰酚114干膏得率1/41/41

根据表2 评分结果，计算得到槲皮素、山柰酚、干膏得率的权重系数分别为0.4444、0.4444、0.1111。一致性比例分子（CR）＜0.1，即指标优先比较矩阵通过一致性检验，权重系数有效。

2.7.3 CRITIC-AHP 通过CRITIC 法和AHP 法分别计算得到三金排石合剂中槲皮素、山柰酚及干膏得率的相关权重，复合权重（

）＝

/∑

，按公式计算得槲皮素、山柰酚及干膏得率复合权重分别为0.4023、0.3953、0.2023。

2.8 Box-behnken 响应面法优化提取工艺

2.8.1 单因素试验参考文献进行相关的预试验，根据结果选定加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）等连续变量作为影响因素进行单因素试验，由单因素试验的结果设计响应面试验各因素的水平范围，因素水平见表3。

表3 响应面试验因素与水平
Tab 3 Factor and level of response surface methodology

因素水平－101 A 加水量/倍81012 B 提取时间/h0.511.5 C 提取次数/次123

2.8.2 响应面试验设计及结果由综合评价指标对水提取工艺的影响，结合各项指标对其进行运算，确定综合评分（

）＝[（槲皮素含量/槲皮素最大含量）×0.4023 ＋（山柰酚含量/山柰酚最大含量）×0.3953 ＋（干膏率含量/干膏率最大含量）×0.2023]×100。

根据响应面的组合设计原理，采用Design Expert 8.0.6 软件，选择Box-Behnken 拟合模型，设置5 个中心试验点，以3 个指标总含量的综合评分为响应值，设计出17 个试验点的试验方案，对加水量、提取时间、提取次数进行研究，结果见表4。

表4 响应面试验设计及结果
Tab 4 Design and results of response surface methodology

试验号A.加水量B.提取时间C.提取次数槲皮素/（mg·g－1）山柰酚/（mg·g－1）干膏得率/%综合评分1－1010.032 330.056 0623.911776.4847 2 1 1 0 0.031 000.052 4822.366372.2465 3－100.040 220.058 4321.526689.9235 4 1 0－10.030 160.050 0715.743965.0890 1 5－1100.030 130.053 4020.385170.3987 6 0 0 0 0.037 680.058 8221.838281.0887 7－10－10.024 850.042 4213.076954.3207 8 1 0 1 0.032 870.050 6423.928574.1956 0.038 440.066 8525.968289.1208 10－1－100.038 220.063 7919.282482.1411 110－1－10.031 880.054 3513.628867.1908 1201－10.032 310.050 6415.246766.9264 130－110.044 850.076 7922.017996.9135 140000.035 170.060 4421.938579.7510 150000.035 940.057 4020.783177.9732 160000.040 340.067 6121.413487.6696 170000.037 290.065 0021.577283.7178 9 0 1 1

2.8.3 试验结果分析采用Design Expert 8.0.6对17 个试验点对应的数据进行方差分析，结果见表5，其中

＜0.05 为显著项，

＜0.01 为极显著项，同时得到三因素与综合评分的三元二次方程：

＝82.04 ＋2.26

－4.68

＋10.40

－1.48

－3.26

－1.88

－7.94

＋4.58

－6.58

。

表5 方差分析
Tab 5 Analysis of variance

来源平方和自由度均方F 值P 值模型1679.429186.607.790.0065 A 40.99140.991.710.2321 B 175.561175.567.330.0303 C 865.021865.0236.110.0005 AB8.8018.800.370.5635 AC42.62142.621.780.2240 BC14.17114.170.590.4670 A2265.381265.3811.080.0126 B288.18188.183.680.0965 C2182.221182.227.610.0282残差167.68723.35失拟项110.49336.832.580.1915误差57.19414.30总和1847.1116

该模型显著性检验

＝0.0065 ＜0.05，模型表现为显著，二次多项式回归模型具有显著性意义；模型的失拟项

＝0.1915 ＞0.05，提示模型与实测数据拟合度好，模型值的运算可替代实际试验值对结果进行预测分析；提取工艺考察的3个因素通过分析相应

值可知，各因素影响大小依次为：C ＞B ＞A，即对三金排石合剂中所含的各项指标及综合评分影响最大的是提取次数，其次是提取时间和加水量。另外，模型的决定性系数

＝0.9092，表明该模型可解释3 个因素90.92%的变异性，校正决定系数

A＝0.7925，说明该模型拟合程度良好，且能解释79.25%响应值的变化，即模型可用于对三金排石合剂的综合评分及各项指标的预测。

根据分析结果绘制响应面3D 图，对加水量、提取时间、提取次数这三个因素每两两之间的交互作用强弱进行比较，结果见图2。

图2 加水量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）交互作用的三维响应面图Fig 2 3D response surface of water adding amount（A），extraction time（B）and extraction times（C）

从三个交互因素形成的曲面陡峭程度可以看出，提取次数与加水量的交互影响最大，影响综合评分的主次顺序为提取次数＞加水量＞提取时间，以上分析与表5 中方差分析的结果吻合。

采用Design Expert 8.0.6 预测最佳提取工艺参数：加水量为10.09、提取时间为0.5 h、提取次数为2.92 次。综合实际操作的便利性，调整为：加水量为10 倍量、提取时间为0.5 h、提取次数为3 次，在此条件下模型预测的综合评分为97.05。

2.9 验证试验

按照优化条件进行3 次平行试验，实际测得综合评分均值为97.50，与预测值相比相对误差小于5%，表明，本试验建立的回归模型适用于三金排石合剂中各种指标的综合评分的预测，与实际测定数值拟合度较好，优化得到的提取工艺参数准确可靠，结果见表6。

表6 验证结果
Tab 6 Verification test

编号槲皮素/（mg·g－1）山柰酚/（mg·g－1）干膏得率/%综合评分10.041 150.070 1720.772299.3521 20.039 960.068 3621.450196.6734 30.041 010.067 2920.754396.4611

3 讨论

3.1 盐酸加入量对槲皮素、山柰酚含量的影响

对供试品溶液制备方法中盐酸加入量（5、6、7、8、9、10、11 mL）进行考察，结果显示，槲皮素、山柰酚的含量呈现先增加再递减的趋势，当盐酸加入量为6 mL 时两者含量达到最大，因此，最终确定其加入量为6 mL。

3.2 权重方法的选取

本试验采用CRITIC-AHP 复合加权法计算权重。CRITIC 法是从实际数据出发，利用指标值所反映的客观信息确定权重的一种方法，此法容易忽视指标间的轻重关系。AHP 法是基于研究者的经验，人为确定各项指标的重要性进行比较而赋权的方法，能切合实际考虑试验中各指标的优选顺序，但主观性较强，易受影响，结果不具有普遍性。AHP-CRITIC 法复合加权法共具两种方法的优点，主客观并重，其结果具有稳定性和可靠性，且能区分数据信息。

3.3 Box-Behnken 响应面法

本研究采用Box-Behnken 响应面法对三金排石合剂的提取工艺进行了研究，通过多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，能够准确表示试验设计与优化结果，与正交试验相比准确度更高、可预测性更强。该模型预测最佳工艺为加入加水量为10倍量水、提取时间为0.5 h、提取次数为3 次。验证试验结果与预测值相比，误差小于5%，说明利用Box-Behnken 响应面法结合AHP 法优化三金排石合剂的提取工艺，方法科学、合理可行、稳定可靠，为进一步开发中药治疗泌尿系结石提供参考依据。