超高效液相色谱-飞行时间质谱法鉴定蛇胆汁特征成分及其应用研究

黄博，黄清泉，白桂昌，罗轶，朱雪妍（广西壮族自治区药品检验所国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室，南宁 530021）

蛇胆汁为眼镜蛇科、游蛇科或蝰科多种蛇的胆汁，为常用中成药蛇胆川贝液、蛇连川贝散、牛黄蛇胆川贝液（胶囊、滴丸）等的主要原料。由于蛇胆汁具有独特的药用价值，加上市场需求量大，自然资源递减，价格昂贵，市场上以鸡、鸭、羊、猪、牛等动物胆汁冒充蛇胆汁和掺伪的情况时有发生，给药品的正确使用、市场监管带来了一定困难。因此，需要建立蛇胆汁专属性的鉴别方法。已有研究表明，蛇胆汁主要含有各种胆汁酸，如牛磺胆酸（TCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、甘氨去氧胆酸等，由于蛇胆汁的功效成分尚不明确，目前多以牛磺胆酸为指标对蛇胆汁进行质量控制。但文献显示，鸡、羊、牛等动物胆汁也含有以上胆汁酸类成分，因此，以上述成分为指标建立的分析方法无法真正区分蛇胆汁和其他动物胆汁。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）可对成分进行结构预测分析，具有快速、高效、灵敏度高的特点，在中药研究方面已经得到广泛应用。因此，本研究拟采用UPLC-Q-TOF-MS 技术结合主成分分析（PCA）法，从整体上对蛇胆汁和其他动物胆汁的化学成分进行分析比较，找出蛇胆汁区别于其他动物胆汁的差异性成分，并建立了基于特征离子的HPLC-MS-MS 鉴别方法。

1 仪器与试药

戴安Ultimate3000 液相系统（美国Thermo公司）；布鲁克ImpactII Q-TOF-MS 系统（德国Bruker 公司）；安捷伦1290 超高效液相系统、安捷伦6490 三重串联四极杆质谱（美国Agilent 公司）；MILLI-PROA 纯水处理器（德国默克密理博公司）。Sartorius CP224S 万分之一电子分析天平、梅特勒-托利多XS205 十万分之一电子分析天平（德国Sartorius 公司）；KQ-600VDB 型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇、乙酸铵、乙腈均为色谱纯（德国MERCK 公司）。

原蛇胆汁（活蛇取胆，立即用50%乙醇1∶1浸泡，活蛇由广西梧州制药集团股份有限公司协助收集，经广西壮族自治区食品药品检验所主任药师谢培德鉴定）样品15 种，生产企业投料蛇胆汁样品26 批，其他动物胆汁收集于菜市场，见表1 ～2，所有样品均经50%乙醇1∶1 浸泡处理。蛇胆汁对照药材（批号：120938-200705，每瓶装60 mg，相当于蛇胆汁5 mg）及牛磺胆酸钠对照品（批号：110815-201510，含量87.9%）（中国食品药品检定研究院）。41 批蛇胆川贝液样品来源于广西专项抽验。

表1 蛇胆汁样品信息表
Tab 1 Information for snake bile samples

序号品种数量/条序号品种数量/条1乌梢蛇3 9 蝮蛇3 2王锦蛇3 10 玉斑锦蛇3 3滑鼠蛇3 11 百花锦蛇3 4金环蛇3 12 三索锦蛇3 5银环蛇3 13 赤练蛇3 6眼镜蛇3 14 黑眉锦蛇3 7蕲蛇3 15 眼镜王蛇3 8蝰蛇3

表2 其他动物胆汁样品信息表
Tab 2 Information for bile samples from other animals

序号品种数量序号品种数量1鸡4 只4羊4 只2鸭5 只5猪5 只3牛4 头6狗4 只

2 超高效液相-四极杆-飞行时间质谱方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Thermo AcclaimRSLC 120 C（2.2 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：甲醇（A）-10 mmol·L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0 ～5 min，30%→50%A；5 ～20 min，50%→90%A；20 ～25 min，90%A；25 ～26 min，90%→30%A；26 ～30 min，30%A）；柱温35℃，流速0.3 mL·min，进样量1 μL。

2.1.2 质谱条件 离子化模式：ESI；干燥气温度：220 ℃；干燥气流速：8 L·min；雾化气压力：2 bar；毛细管电压：3500 V；喷嘴电压：500 V；校正液：甲酸钠溶液；扫描范围：50 ～1000，扫描频率1 Hz。

2.2 供试品溶液的制备

精密吸取胆汁50 μL，置2 mL 离心管中，精密加入50%甲醇950 μL，摇匀，过0.22 μm 滤膜，即得。

2.3 蛇胆汁成分研究

采用UPLC-Q-TOF-MS 技术，对蛇胆汁的成分进行研究。对获得的数据进行处理，根据文献和获取的对照品进行定位，对色谱峰进行归属；对其他质谱响应较高的化合物，则根据分子量进行推测。在负离子模式下，蛇胆汁共检测出38个成分，见图1 和表3。

图1 蛇胆汁组分叠加图Fig 1 Superposed graph of snake bile components

结合文献报道，从表3 可看出，蛇胆汁中的绝大部分成分为胆酸类成分，牛磺胆酸为蛇胆汁的主要成分，其他为在牛磺胆酸结构式的基础上加减-H、-OH、-SOH、-CH等基团。

表3 蛇胆汁成分分析
Tab 3 Components of snake bile

注：“/”表示无法分析。
Note：“/”indicates that it cannot be analyzed.

No.保留时间/min化学式[M-H]－误差 英文名/化学名11.10 C4H7NaO4141.01690.3 sodium diacetate/双乙酸钠21.29 C6H13NO2341.10900.2 maltose/亮氨酸33.37 /443.1744//43.55 C26H44NO10S2 296.6175（双电荷）1.9 /54.58 C21H34NO10S2 254.0729（双电荷）0.5 /65.00 C26H44NO10S2 594.24140.3 /75.22 C26H45NO7S 514.28430.2 /85.46 C26H44NO11S2 304.6150（双电荷）1.7 /95.73 C19H32O8S2225.0701（双电荷）1.9 /10 6.19 C26H45NO10S2 296.6175（双电荷）1.9 /11 6.53 C26H45NO10S2 594.24100.4 sulfate of taurocholate /牛磺胆酸硫酸酯12 6.79 C22H43NO14S 287.6121（双电荷）3.0 /13 7.00 C26H45NO10S2 296.6174（双电荷）1.6 14 7.37 C26H45NO9S2 288.6196（双电荷）0.6 /15 7.90 C26H45NO9S2 288.6197（双电荷）0.7 /16 8.3C26H45NO7S 514.28371.3 17 8.55 C26H43NO9S2 287.6119（双电荷）0.6 /18 8.91 C26H45NO9S2 288.6199（双电荷）1.2 sulfate of taurodeoxycholate /牛磺去氧胆酸硫酸酯19 9.26 C26H43NO7S 512.26791.7 /20 9.45 C30H51NO10S2 323.6409（双电荷）1.3 /21 9.73 C26H45NO7S 514.28371.4 22 9.92 C26H43NO8S2 279.6147（双电荷）1.5 /23 11.00 C26H43NO7S 512.26830.8 /24 11.15 C30H50O11S2 324.1328（双电荷）1.1 /25 11.26 C28H48O10S2 303.1276（双电荷）1.5 /26 11.66 C28H46O8S541.28351.1 /27 12.00 C26H45NO7S 514.28470.6 taurocholic acid/牛磺胆酸28 13.51 C30H51NO7S 568.33100.5 /29 14.55 C26H45NO6S 498.28881.6 ethanesulfonic acid/牛磺鹅去氧胆酸30 14.72 C27H48O7S515.30440.8 /31 15.01 C26H44O9499.29201.6 /32 17.07 C29H52O7S543.33540.7 /33 20.25 C20H32O2303.23241.7 /34 21.02 C16H32O2255.23251.6 /35 21.14 C17H34O6333.22810.6 /36 21.37 C18H34O2281.22802.1 /37 22.63 C32H64O4255.2325（双电荷）1.7 /38 22.82 C18H36O2283.26362.2 /

2.4 蛇胆汁特征成分的筛选

为考察蛇胆汁和其他动物胆汁之间的差异，本实验对蛇胆汁和其他动物胆汁进行UPLC-QTOF-MS 分析，每种动物胆汁的基峰离子流图见图2。以Profileanalysis 应用软件对质谱数据进行分析。首先对每一针样品找出分子特征成分，分子特征成分检测参数为：保留时间范围1 ～30 min，质谱范围为

m/z

50 ～1000，噪音阈值为20，相关系数阈值0.7，最小化合物长度10 谱图，在此参数基础上每针样品均找出200 个以上的分子特征成分，再用PCA 法对全部数据进行分析处理，结果见图3。

图2 乌梢蛇胆汁（A）、鸡胆汁（B）、鸭胆汁（C）、牛胆汁（D）、羊胆汁（E）、猪胆汁（F）、狗胆汁（G）的基峰离子流图Fig 2 Basic peak chromatogram of the bile from Zaocys dhumnades（A），chicken（B），duck（C），bovine（D），sheep（E），pig（F），and dog（G）

图3A 显示，不同动物胆汁大致分别落在不同区域，蛇胆汁主要分布于评分图的左下方，与其他动物胆汁明显分离。图3B 中每个点均代表一个分子特征成分，图中心的分子特征成分对样品的区分没有贡献，而距离中心越远的数据对样品差异贡献越大，得分和载荷图中的方向是相互关联的。从左下方的数据群里筛选出两个代表蛇胆汁专属性的特征成分，再基于化学成分的精确质量数（≤2 mDa）和同位素丰度（≤20 mSigma），推断出两个特征成分的分子式，结果见表4。

表4 蛇胆汁特征成分的鉴定
Tab 4 Identification of marker of snake bile

No.保留时间/min实测值[M-H]－理论值[M-H]－ 误差同位素丰度分子式S18.94 578.2464 578.2463 0.113.8C26H45NO9S2 S26.51 594.2415 594.2412 0.318.3C26H45NO10S2

图3 蛇胆汁和其他动物胆汁的PCA 得分图（A）和载荷图（B）Fig 3 PCA score（A）and loading plot（B）of the snake bile and bile from other animals

对上述特征成分进行结构解析：蛇胆汁的主要成分为牛磺胆酸，另含有少量牛磺鹅去氧胆酸，S1 的二级碎片498.288 为牛磺鹅去氧胆酸的[M-H]峰，而480.277 和124.007，则是牛磺鹅去氧胆酸的碎片离子，因此该成分含有牛磺鹅去氧胆酸的母核，而96.960 碎片离子，是HSO的[M-H]峰，故推断S1 成分为牛磺鹅去氧胆酸3 号位的羟基被硫酸酯化所生成，将其称为牛磺去氧胆酸-3-硫酸酯（SOTDC），碎片解析见图4 ～5。同理，S2 二级碎片包含514.283、496.272、124.007 三个碎片离子，分别是牛磺胆酸的[M-H]峰及其丰度较大的两个碎片离子，因此推测S2 是牛磺胆酸3 号位的羟基被硫酸酯化所生成，将其称为牛磺胆酸-3-硫酸酯（SOTC），碎片解析见图6 ～7。

图4 蛇胆汁特征成分（S1）选择离子流色谱图（A）及其一级（B）、二级（C）质谱图Fig 4 Selected ion chromatogram（A）and MS1（B）and MS2（C）spectra of markers of the snake bile（S1）

图5 牛磺鹅去氧胆酸和蛇胆汁特征成分（S1）结构式及其可能的裂解途径Fig 5 Structural formula of taurodeoxycholic acid and markers of snake bile（S1）and possible fragmentation pathways

图6 蛇胆汁特征成分（S2）选择离子流色谱图（A）及其一级（B）、二级（C）质谱图Fig 6 Selected ion chromatogram（A）and MS1（B）and MS2（C）spectra of markers of the snake bile（S2）

3 基于三重串联四极杆质谱蛇胆汁特征成分检测方法的建立

3.1 HPLC-MS-MS 条件

采用三重串联四极杆质谱来建立多反应监测（MRM）的检测方法。

3.1.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse Plus C柱（1.8µm，2.1 mm×100 mm）；流动相：甲醇（A）-10 mmol·L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0 ～10 min，40%→50%A；10 ～25 min，50%→80%A；25 ～25.5 min，80%→40%A；25.5 ～30 min，40%A）；柱温35℃，流速0.3 mL·min，进样量1 μL。

3.1.2 质谱条件 离子化模式：ESI；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12 L·min；雾化气压力：20 psi；鞘流气温度：350 ℃；鞘流气流速：11 L·min；离子漏斗参数：高压150 V，低压60 V；毛细管电压：3 kV；喷嘴电压：1000 V。

图7 牛磺胆酸和蛇胆汁特征成分（S2）结构式及其可能的裂解途径Fig 7 Structural formula of taurocholic acid and markers of snake bile（S2）and possible fragmentation pathway

根据每个特征成分的二级碎片，均选取了两组MRM 离子对信息，并对离子对的碰撞能量进行优化，建立HPLC-MS-MS 方法。牛磺去氧胆酸硫酸酯（SOTDC）检测离子对为578.2 →498.3（定量）和578.2 →124.0，碎裂电压均为380 V，碰撞能量分别为30 V、70 V；牛磺胆酸硫酸酯（SOTC）检测离子对为594.2 →514.3（定量）和594.2 →124.0，碎裂电压均为380 V，碰撞能量分别为30 V、70 V。

选取鸡、鸭、牛、羊、猪、狗等动物胆汁样品按“2.2”项下方法制备后进样测定，按上述蛇胆汁两个特征成分离子对进行检测。经实验结果确认，蛇胆汁样品中全部有质谱信号检出，而其他动物胆汁样品均未检出，见图8。表明据此所建立的的液相色谱-串联质谱方法准确性良好，且所筛选的蛇胆汁特征成分具有特异性。

图8 乌梢蛇胆汁（A）、鸡胆汁（B）、鸭胆汁（C）、牛胆汁（D）、羊胆汁（E）、猪胆汁（F）、狗胆汁（G）的选择离子色谱图Fig 8 Selective ion chromatogram of the bile from Zaocys dhumnades（A），chicken（B），duck（C），bovine（D），sheep（E），pig（F），and dog（G）

3.2 蛇胆汁对照药材溶液

取蛇胆汁对照药材约10 mg，精密称定，加50%甲醇10 mL，超声处理（功率320 W，频率40 kHz）10 min，过0.22 μm 滤膜，即得。

3.3 方法学验证

考察了精密度、重复性和稳定性，结果表明SOTDC 和SOTC 的精密度（

n

＝6）、重复性（

n

＝6）、稳定性（24 h 内，

n

＝6）

RSD

均小于3.0%，符合要求。

4 蛇胆川贝液中蛇胆汁特征成分检测方法的建立

为了将建立的蛇胆汁鉴别方法应用于处方制剂中，笔者以蛇胆川贝液为例，在上述蛇胆汁特征成分检测方法的基础上，建立了蛇胆川贝液中蛇胆汁的鉴别方法。

4.1 蛇胆汁对照药材溶液

蛇胆汁对照药材溶液的制备同“3.2”。

4.2 供试品溶液

取蛇胆川贝液供试品溶液5 mL，加水5 mL，加冰醋酸0.5 mL，摇匀，以每秒1 ～2 滴的速度过HLB 小柱（200 mg，使用前先用6 mL 甲醇，再用6 mL 水活化），用10 mL 水洗脱，弃去水洗液，抽干，再用20 mL 甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，转移至鸡心瓶中，于40℃减压蒸干或氮气吹干，加1 mL 甲醇涡旋使溶解，过0.22 μm 滤膜，即得。

4.3 阴性样品溶液

取缺蛇胆汁的阴性样品5 mL，按“4.2”项下供试品溶液的制备方法操作，即得。

4.4 专属性试验

吸取蛇胆汁对照药材溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各2 μL，分别按“3.1”项下色谱条件和质谱条件，进样分析，结果含蛇胆汁的阳性样品色谱中，在与对照药材色谱相应的保留时间位置上，呈现上述离子流色谱峰；阴性样品色谱中，在与对照药材色谱相应的保留时间位置上无相应的离子流色谱峰，各药味对测定无干扰，结果见图9。

图9 蛇胆汁对照药材（A）、蛇胆川贝液阴性样品（B）和蛇胆川贝液阳性样品（C）的选择离子色谱图Fig 9 Selected ion chromatogram of snake bile control（A），negative sample of Shedan Chuanbei decoction（B）and positive sample of Shedan Chuanbei decoction samples（C）

4.5 方法学验证

考察了精密度、重复性和稳定性，结果表明蛇胆川贝液中SOTDC 和SOTC 的精密度（

n

＝6）、重复性（

n

＝6）、稳定性（24 h 内，

n

＝6）

RSD

均小于3.0%，符合方法学要求。

4.6 样品测定

以拟订的方法对监督抽样的41 批蛇胆川贝液样品进行检验，结果有一批样品未检出蛇胆汁的两个专属性成分，该批样品疑似未按处方以蛇胆汁投料。

5 讨论

UPLC-Q-TOF-MS 技术可以同时提供良好的分离效果，提供精确的、丰富的质谱信息，被广泛用于中药复杂成分的在线快速鉴别。本实验结合主成分分析法分析蛇胆汁和其他动物胆汁的差异。结果表明，利用该方法能区分蛇胆汁和其他动物胆汁，并找出具有鉴别意义的特征性成分，分别为牛磺去氧胆酸硫酸酯（CHNOS）和牛磺胆酸硫酸酯（CHNOS），再根据各自的二级碎片，建立了在质谱定性鉴别中较常用且灵敏度很高的三重串联四极杆多反应监测方法。但目前这两个成分均无法在市场上获得对照品，只能以蛇胆汁对照药材作为特征成分保留时间的参照，这种通过对照药材图谱对色谱峰定位的思路在一些难以获得对照物质的民族药或动物药上已有尝试。蛇胆川贝液为市面上常见的止咳药，处方中除了蛇胆汁、平贝母，还有薄荷脑、杏仁水、蜂蜜及大量蔗糖等辅料。平贝母的主要成分为生物碱类，而大量的糖浆容易损耗仪器也会增加基质效应，降低灵敏度。综合考虑，在样品前处理中，先将样品用冰醋酸酸化后，再经过耐受酸碱的HLB 固相萃取小柱净化，首先用水洗去糖浆以及酸化成盐的生物碱，再用甲醇将胆汁酸类成分洗脱。本文选择甲醇作为洗脱溶剂，获得了更好的浓缩效率。该方法专属性、重现性均良好，操作方便，能有效控制蛇胆汁不投料的不法行为。