酱油渣中具有抑菌活性的乳酸菌的筛选及其抑菌特性

吕 蕾，杨晓萍，王阿利，钟先锋，黄桂东,，赵嘉乐

（1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山 528231；2.广东省传统发酵食品工程技术研究中心，广东佛山 528231；3.广东省食品流通安全控制工程技术研究中心，广东佛山 528231；4.佛山市酿造工程技术研究中心，广东佛山 528231；5.佛山市农业生物制造工程技术研究中心，广东佛山 528231）

乳酸菌是普遍公认安全（generally recognized as safe，GRAS）的微生物，不仅能赋予食品特殊风味，且部分乳酸菌能分泌细菌素等抑菌物质。乳酸菌所产细菌素是低分子量蛋白质或多肽，能抑制食品腐败，延长货架期，且无毒、无抗药性、无副作用、可被分解消化。目前乳酸菌源细菌素作为新型生物抑菌剂在食品安全方面成为了化学防腐剂的良好替代品，逐渐成为食品科学研究的热点。

发酵食品是产细菌素乳酸菌的重要来源。Gutiérrez-Cortés 等从巴西新鲜手工奶酪中分离出多株乳酸菌，其能产生抑制单核细胞增生李斯特氏菌的细菌素；刘树昕等从新疆传统酸奶中得到一株抑菌效果良好的植物乳杆菌，并鉴定出菌株主要抑菌物质是IIb 类细菌素；舒梨等从浓香型窑泥中分离出抑菌活性较高的副干酪乳杆菌，其抑菌物质是具有蛋白质特性的细菌素。但当前细菌素商业化产品较少，且抑菌特性不稳定。乳酸链球菌的Nisin 是目前唯一被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）官方批准认可的食品防腐剂，因此亟需开发稳定、安全、具有高效抑菌活性的细菌素，作为新型生物抑菌剂延长食品保质期。

酱油渣是酱油发酵结束后残留的固形物质，作为工业副产物产量巨大，其所含微生物和营养物质丰富，主要微生物为乳酸菌、酵母等，具备再次加工利用的潜力。目前，国内外学者对酱油渣中筛选有益菌株的相关研究关注较少。现有研究表明，酱油渣的综合利用基本集中在副产物饲料生产和化工能源方面，如何实现酱油渣中产细菌素的有益微生物筛选和利用的问题仍值得深入探讨。本课题组前期以酱油渣为材料，分离鉴定得到多株乳酸菌，且具有耐受模拟胃肠环境能力、疏水能力及抗氧化能力等特性。为进一步开发现有乳酸菌的有益生物活性，本研究以酱油渣中分离得到的16 株乳酸菌为出发菌株，拟筛选出具有高效抑菌活性的乳酸菌，并通过有机酸、过氧化氢排除试验，酶敏感试验初步分析乳酸菌上清液的抑菌物质和其抑菌特性，为乳酸菌回填以提升酱油耐储藏品质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

16 株乳酸菌 实验室前期从酱油渣中筛选获得，其中ZW2 为已鉴定称为HT31 的副干酪乳杆菌副干酪亚种、ZW9 为已鉴定称为HT4 的乳酸乳球菌霍氏亚种，ZW14 为已鉴定称为HT155 的副干酪乳杆菌坚韧亚种；金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）南京茂捷微生物科技有限公司；大肠杆菌（ATCC 25922）上海鲁傲科技有限公司；MRS 肉汤、酵母提取物、胰化蛋白胨、琼脂粉 广东环凯微生物科技有限公司；胰蛋白酶（2500 U/mg）、蛋白酶K（20 U/mg）、胃蛋白酶（2500 U/mg）、-蛋白酶（400 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（4 U/mg）生工生物工程股份有限公司；氯化钠、吐温-80、Triton X-100、SDS、尿素 天津市大茂化学试剂厂。

ME104 电子分析天平 梅特勒-托利多精密仪器公司；SW-CJ-1FD 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LRH-150 恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；GR60DA 全自动灭菌锅 致微（厦门）仪器；SY-1220 水浴锅 美国精骐有限公司；Epoch2 微孔板分光光度计酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 指示菌悬液制备 参考马国涵等的方法，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于LB 液体培养基中，经3 代活化后，于4 ℃保存备用。

1.2.2 乳酸菌上清液制备 参照马国涵等和杜宏等的方法，16 株乳酸菌甘油菌各取200 μL（2%，v/v）接种于MRS 肉汤中，活化3 代后，4 ℃、6000 r/min离心15 min，0.22 μm 滤膜过滤，得乳酸菌上清液，4 ℃保存备用。

1.2.3 具有抑菌活性乳酸菌的筛选 参照黄奕雯等的方法，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯双层平板法，每个孔中加200 μL 乳酸菌上清液，检测16 株酱油渣源乳酸菌上清液中是否有抑菌物质。经室温扩散4 h，培养箱37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径大小，判断乳酸菌上清液抑菌活性，选取对两种指示菌均有抑菌活力的乳酸菌上清液进行后续抑菌物质分析。

1.2.4 乳酸菌抑菌物质分析 乳酸菌在代谢过程中产生的抑菌物质主要是有机酸、HO和细菌素等，尤其细菌素是蛋白类物质，易被人体蛋白酶降解完全，安全无毒，是极具潜力和应用前景的生物抑菌剂。为进一步明确1.2.3 筛选获得的对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌活性的酱油渣源乳酸菌上清液中的抑菌物质，采用NaOH 中和法，排除发酵产物中有机酸影响，用过氧化氢酶处理排除过氧化氢影响，通过酶敏感试验进一步验证抑菌物质是否是细菌素。

1.2.4.1 有机酸排除试验 参考黄奕雯等的方法，用2 mol/L NaOH 调节乳酸菌上清液的pH 至6.0，用1 mol/L 的乳酸、盐酸、乙酸分别调节MRS 肉汤至pH6.0 和未处理乳酸菌上清液（pH4.2）作为对照，如1.2.3 所示，进行抑菌试验。

1.2.4.2 过氧化氢排除试验 参照黄奕雯等的方法，用0.05 mol/L（pH7.0）的磷酸盐缓冲液溶解适量的HO酶，加入经排酸后的乳酸菌上清液（pH6.0）中，使HO酶终浓度为1 mg/mL。37 ℃水浴2 h，以未处理乳酸菌上清液（pH4.2）和加酶空白培养基作为对照组，如1.2.3 所示，进行抑菌试验。

1.2.4.3 酶敏感验证实验 参照刘树昕等的方法，分别用0.05 mol/L（pH7.0）的磷酸盐缓冲液溶解适量的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、-淀粉酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，分别加入排除酸和HO后的乳酸菌上清液中，使各蛋白酶终浓度均为1 mg/mL，分别将pH 调整为酶最适pH（依次为8.5、2.0、6.5、9.8、7.5），37 ℃水浴2 h。以未经各种酶处理的上清液（pH4.2）和加酶MRS 肉汤为对照组，如1.2.3 所示，进行抑菌试验。

1.2.5 抑菌动力学曲线 参照王萌萌等的方法稍作修改，将1.2.4 筛选出具有抑制效果的菌株按2%（v/v）的接种量加入到100 mL MRS 肉汤中，37 ℃恒温培养，每隔2 h 测OD值，pH 值及乳酸菌上清液对大肠杆菌指示菌的抑菌圈直径，绘制抑菌动力学曲线。

1.2.6 影响乳酸菌上清液抑菌活性的因素

1.2.6.1 温度对乳酸菌上清液抑菌活性影响 参照曹海鹏等方法，将乳酸菌上清液分装5 mL 至试管中，分别置于40、60、80、100 ℃的水浴锅以及121 ℃高压锅中处理30 min，室温冷却，以大肠杆菌为指示菌，参照1.2.3 进行抑菌试验。

1.2.6.2 pH 对乳酸菌上清液抑菌活性影响 参考高欣等方法，将每管5 mL 乳酸菌上清液分别用2 mol/L的HCl 和2 mol/L 的NaOH 溶液调节pH 为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，以大肠杆菌为指示菌，参照1.2.3 进行抑菌试验。

1.2.6.3 紫外线对乳酸菌上清液抑菌活性影响 参考郝艳芳等方法，将每管5 mL 乳酸菌上清液在距离40 W 紫外灯20 cm 处分别照射15、30、60、90、120 min，以大肠杆菌为指示菌，参照1.2.3 进行抑菌试验。

1.2.6.4 表面活性剂对乳酸菌上清液抑菌活性影响参考舒梨等的方法，将表面活性剂吐温-80、Triton X-100、SDS 和尿素分别加入装有5 mL 乳酸菌上清液的试管中，在37 ℃水浴锅温育2 h 后，以大肠杆菌为指示菌，参照1.2.3 进行抑菌试验。

1.3 数据处理

本研究所有实验均重复3 次及以上，数据采用平均值±标准偏差形式，应用Origin 2019 软件进行绘图，并采用SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析，以最小显著差异法（LSD）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 酱油渣源具有抑菌活性的乳酸菌的筛选

前期从酱油渣中筛选分离得到的16 株乳酸菌，编号依次为ZW1～ZW16，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，根据抑菌圈大小进行抑菌活性初步筛选。由表1 可知，大肠杆菌抑菌实验中，12 株菌对大肠杆菌有抑菌作用，其中ZW9 抑菌效果最好，抑菌圈直径为15.63±0.04 mm，抑菌圈最小乳酸菌是ZW7，直径为9.31±0.03 mm；金黄色葡萄球菌抑菌实验中，4 株乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，且ZW9 抑菌效果最好；而ZW6、ZW10、ZW11对两种指示菌均无抑菌效果。整体而言，16 株乳酸菌对两种指示菌有不同的抑制作用，且乳酸菌上清液对大肠杆菌的抑制效果更明显。其中，菌株ZW2、ZW9、ZW14 同时对两种指示菌的抑菌效果较好，可进一步研究菌株产生的抑菌物质及其影响因素。

表1 不同乳酸菌上清液对指示菌的抑制作用（mm）Table 1 Inhibitory effect of different lactic acid bacteria supernatant on indicator bacteria (mm)

2.2 酱油渣源乳酸菌抑菌物质分析

2.2.1 酸排除结果 排酸试验结果如表2 所示。结果显示，采用NaOH 中和后的pH6.0 乳酸菌上清液对两种指示菌具有明显的抑制作用，与未经处理乳酸菌上清液（pH4.2）抑菌活性相比差异不显著（>0.05），说明排除酸作用后对两种指示菌抑菌圈仍明显；而1 mol/L 的乳酸、乙酸、盐酸调节pH 至6.0 的MRS肉汤对两种指示菌无抑菌作用。由此推测，有机酸不是乳酸菌上清液抑菌作用的主要物质，还可能存在其他抑菌物质，这与马迎涛进行的副干酪乳杆菌的排酸试验结果一致。

表2 有机酸对乳酸菌上清液抑菌活性的影响（mm）Table 2 Effect of organic acids on antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant (mm)

2.2.2 过氧化氢排除结果 HO排除试验结果见表3，经HO酶处理的乳酸菌上清液与未经处理的乳酸菌上清液相比，均具有抑菌活性。经HO酶处理的乳酸菌上清液其抑菌活性仅降低了5.59%～9.90%，说明HO不是主要抑菌作用因素，该结果与涂小丽等的研究：用HO酶处理后的乳酸菌上清液对两种指示菌仍有较强抑制作用一致，提示乳酸菌上清液可能存在其他抑菌物质。

表3 过氧化氢酶处理对乳酸菌上清液抑菌活性的影响（mm）Table 3 Effect of catalase treatment on antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant (mm)

2.2.3 酶敏感性结果 酶敏感试验结果如表4 所示。经6 种蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、-蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶K）处理的乳酸菌上清液对两种指示菌的抑制效果有不同程度变化。胰蛋白酶处理的乳酸菌上清液与未经酶处理的乳酸菌上清液相比，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性显著降低（<0.05）；胃蛋白酶处理的乳酸菌上清液与未经处理的乳酸菌上清液相比，对大肠杆菌的抑菌活性显著降低（<0.05），而对金黄色葡萄球菌无抑菌作用；-蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶K 处理的乳酸菌上清液对两种指示菌无抑制作用。上述结果表明，3 株乳酸菌上清液的抑菌物质对蛋白酶敏感，能被其分解，初步推断是一种具有蛋白质类特性的细菌素，乳酸菌上清液中该物质具备良好的抑菌效果，与Zhang 等研究具备抑菌作用的细菌素对蛋白酶敏感的结果一致。

表4 不同酶处理对乳酸菌上清液抑菌活性的影响（mm）Table 4 Effect of different enzyme treatments on antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant (mm)

2.3 抑菌动力学曲线

经抑菌活性乳酸菌的筛选和抑菌物质分析发现，菌株ZW2、ZW9、ZW14 发酵上清液对大肠杆菌抑制作用较好，以大肠杆菌为指示菌，进一步研究菌株的抑菌动力学曲线，结果如图1 所示。菌株的生长曲线显示：菌株生长呈典型的“S”型，在迟缓期4 h 内，3 株菌增长缓慢，OD值变化不明显；培养4 h 后进入生长对数期，随着发酵时间的延长，菌液浓度呈指数增长，细胞代谢活跃；培养20 h 后达到生长稳定期，3 株乳酸菌OD均稳定在1.5 左右。菌株的pH 变化曲线显示：乳酸菌从接种至培养4 h 时，pH 有小幅下降；培养4～20 h 时，pH 迅速下降；培养20～28 h 时，pH 趋于3.5 左右，说明3 株菌有一定产酸能力。以大肠杆菌为指示菌株，乳酸菌上清液的抑菌活性显示：进入生长对数期后菌株开始呈现抑菌活性，随培养时间的延长，抑菌圈直径不断增大，20 h 后抑菌圈直径趋于稳定。上述结果表明，抑菌物质产生于生长对数期，随菌液浓度增加，pH 不断降低，细菌素的抑菌活性不断增强；在稳定期时，培养基中碳源和氮源的耗尽使细菌生长受到抑制，代谢物产量、pH 与抑菌活性趋于稳定，这与涂小丽等和张建飞等报道的乳酸菌抑菌动力学曲线总体变化结果一致。综上所述，选取培养时间20 h 为最佳观察抑菌圈直径时间。

图1 ZW2、ZW9、ZW14 菌株的抑菌动力学曲线Fig.1 Antimicrobial kinetics curves of ZW2,ZW9,ZW14

2.4 乳酸菌上清液抑菌效果影响因素研究

2.4.1 温度稳定性 温度是影响蛋白质的空间结构及生物功能的主要因素之一，随温度升高蛋白质空间结构遭到破坏，相应的生物功能也发生变化。在食品工业中，巴氏杀菌温度为65～80 ℃，微生物（含芽孢）灭菌温度为121 ℃，为探究乳酸菌上清液的抑菌物质对温度的耐受性情况，选择40～121 ℃区间进行观察，如图2 所示。结果显示，经40、60、80、100 ℃处理后，菌株ZW2、ZW9 的抑菌圈直径基本无变化（>0.05），经121 ℃处理后抑菌活性降低（<0.05）；ZW14 上清液经60、80、100、121 ℃处理后，抑菌圈直径显著减小（<0.05）。3 株乳酸菌经热处理的上清液与未经热处理的上清液相比，抑菌活性均出现一定程度的下降，这是由于高温引起部分蛋白或多肽失活，但菌株上清液的抑菌活性仍保持在90%以上。结果表明，3 株乳酸菌上清液细菌素具有极好的热稳定性，与Qiao 等从传统发酵马奶筛选到壳状乳杆菌细菌素经加热处理后仍保持较好抑菌活性的结果一致。耐高温的细菌素在食品工业高温灭菌生产过程中具有较大优势。细菌素是乳酸菌产生的具有抑菌活性的主要物质，Ishibashi 等和Han 等研究显示乳酸菌产生多是Class Ⅱb 类双肽细菌素，且Class Ⅱ类细菌素耐热性强，推测本研究乳酸菌所产可能为Class Ⅱb 类细菌素。

图2 温度对乳酸菌细菌素的影响Fig.2 Effect of temperature on lactic acid bacteriocin

2.4.2 pH 耐受性 乳酸菌上清液对pH 敏感性结果如图3 所示。结果表明，3 株乳酸菌的抑菌物质对pH2.0～6.0 环境具有较强耐受性，而在中性、碱性环境（pH8.0～10.0）条件下，抑菌活性降低甚至丧失。Zacharof 等研究也发现酸性条件有助于乳酸菌细菌素更有效地吸附到致病菌上，从而能发挥更好的杀菌效果。pH 增高会导致分子内静电相互作用而引起细菌素结构改变，从而导致抑菌活性下降甚至彻底丧失。3 株乳酸菌细菌素的酸性耐受性强，有利于作为生物抑菌剂应用在酸性食品保鲜中。

图3 pH 对乳酸菌细菌素的影响Fig.3 Effect of pH on bacteriocin of lactic acid bacteria

2.4.3 紫外线敏感性 蛋白质的氢键经过紫外辐照后会被破环，甚至会使某些蛋白质丧失基础功能，最终导致蛋白性质改变，乳酸菌上清液对紫外线敏感性如图4 所示。由图4 数据变化规律可知，3 株乳酸菌细菌素在不同时间紫外线辐射下均表现出抑菌活性，而对紫外线耐受性不尽相同。随着紫外线照射时间增加，紫外线辐射60 min 后3 株乳酸菌上清液抑菌效果与未经处理的上清液相比，呈显著性下降（<0.05），但紫外线辐射120 min，乳酸菌上清液抑菌活性仍保留近80%。由此可见，3 株乳酸菌细菌素对紫外线敏感性较弱。本研究结果与冉军舰等研究嗜酸乳杆菌在紫外照射超过1 h 其抑菌活性才有显著性降低的报道相似。ZW2、ZW9、ZW14 乳酸菌细菌素作为生物抑菌剂对紫外线有很好的耐受性，适用于食品工业中需紫外线杀菌消毒的食品。

图4 紫外线对乳酸菌细菌素的影响Fig.4 Effects of ultraviolet on lactic acid bacteriocin

2.4.4 表面活性剂敏感性 乳酸菌上清液经不同表面活性剂处理后的抑菌活性变化如图5 所示，3 株乳酸菌上清液均具有一定抑菌活性，并且细菌素对不同表面活性剂敏感性不同。乳酸菌上清液经吐温-80、Triton X-100、SDS 处理后对大肠杆菌抑菌圈直径均大于未经处理的上清液，3 种表面活性剂显著提高乳酸菌上清液的抑菌能力（<0.05），推测它们改变了蛋白质空间结构，使细菌素溶解度增大，稳定性提高，从而增强了抑菌效果，这与李志如等研究表面活性剂的试验结果一致。而经尿素处理的乳酸菌上清液与未经处理的上清液相比，抑菌活性呈显著性下降（<0.05），推测尿素对抑菌物质有一定拮抗作用，能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性失活，但抑菌活性仍保留80%～90%。

图5 表面活性剂对乳酸菌细菌素的影响Fig.5 Effects of surfactant on lactic acid bacteriocin

3 结论

本论文以实验室前期从酱油渣中分离的16 株乳酸菌作为出发菌株，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌，筛选得到了具有高效抑菌活性的乳酸菌ZW2、ZW9、ZW14。经有机酸排除、HO排除、酶敏感试验分析，有机酸和HO不是菌株主要抑菌物质，可能存在具有蛋白质属性的抑菌活性物质。菌株的抑菌动力学曲线和抑菌活性稳定性结果显示，3 株乳酸菌在培养20 h 后抑菌活性趋于稳定；菌株中的抑菌物质在40～100 ℃具有良好的热稳定性；菌株在pH2.0～6.0 中抑菌效果较强，对酸具有较好的耐受性；菌株中的抑菌物质对紫外线不敏感；表面活性剂吐温-80、Triton X-100、SDS 对菌株抑菌活性有促进作用，而尿素对抑菌活性有一定抑制作用。综上所述，通过酱油渣筛选获得的ZW2、ZW9、ZW14 乳酸菌细菌素，在高温处理的食品保鲜、酸性食品保鲜、紫外灭菌食品保鲜等生物防腐方面具有应用潜力，为后续研究3 株乳酸菌细菌素类型、抑菌作用机理及安全性奠定了基础，也为酱油渣源乳酸菌资源开发应用提供了科学依据。