正交试验优选羽扇豆醇提取工艺及液相色谱法-质谱法联用(LC-MS)与气相色谱法-质谱法联用检测比较

任天和 潘年松 罗 俊

(1 贵州医科大学基础医学院，贵阳，550004；2 遵义医药高等专科学校，遵义，563006)

马棘(Indigofera Pseudotinctoria)是豆科，木蓝属小灌木。主要分布于云南、贵州、四川、湖南、湖北等地，也是优质的青饲料[1]。有研究发现在马棘提取物石油醚层鉴定出羽扇烯酮，在同豆科的截叶铁扫帚中，测得羽扇烯酮和羽扇豆醇含量均为主要成分[2-3]。羽扇豆醇属于五环羽扇豆烷型三萜类化合物，广泛存在于无花果、葡萄、大豆等多种水果蔬菜中，具有抗肿瘤、抗氧化、降糖、抗炎、护肝等药理活性[4-5]。

气相色谱法-质谱法联用(Liquid Chromatograph-mass Spectrographyr，LC-MS)和气相色谱法-质谱法联用(Gas Chromatography-mass Spectrography，GC-MS)均有很高的灵敏度与专属性，结合质谱对不同离子的响应，可以快速定性分离化合物成分信息。在众多领域有广泛的应用，在代谢组学中更是互为补充[6]。

1 材料

1.1 样品及标准品 马棘种子(遵义绿普森农业科技开发有限公司)；羽扇豆醇标准品(成都普思生物科技股份有限公司，生产批号：PS020067)。

1.2 仪器 液质联用仪(AB，美国，型号：SCIEX 4000Q trap LC-MS/MS)；LC色谱柱(AcclaimTM，美国，型号：120 C18 4.6 mm×150 mm 5 μm)；气质联用仪(Thermo ScientificTM，美国，型号：ISQTM7000单四极杆GC-MS)；GC色谱柱(Thermo，美国，型号：TG-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

2 方法

2.1 单因素试验

根据现有文献[7-11]报道，选取溶剂与时间2个因素，进行马棘种子提取单因素试验，烘干溶剂得浸膏。通过LC-MS检测计算羽扇豆醇含量。

2.1.1 LC-MS含量检测 标准品及样品制备：精密称取4.0 mg样品，溶解于1 mL甲醇中，超声溶解，过0.22 μm滤膜，4 ℃保存备用。精密称取1.0 mg标准品，溶解于1 mL甲醇中，配成1 mg/mL浓度，过0.22 μm滤膜。并依次稀释至320 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL，4 ℃保存备用。

2.1.2 LC-MS条件 流动相：0.1%甲酸甲醇(0.1%甲酸水=90∶10)，进样量：1 μL，流速：0.8 mL/min。羽扇豆醇的准确分子质量：426.4，母离子：453.2，子离子：435.4，DP：102，CE：32。

2.2 正交试验

以单因素试验为基础，设计三因素三水平正交试验。烘干样品后通过GC-MS检测分析羽扇豆醇最佳提取方案及影响因素。见表1。

表1 羽扇豆醇浸提工艺因素水平

2.2.1 GC-MS成分检测 标准品及样品制备：精密称取各样品20 mg，溶于1 mL乙醚中，震荡溶解后过0.45 μm滤膜，4 ℃保存备用。精密称取1.0 mg标准品，溶解于1 mL乙醚中，过0.45 μm滤膜，4 ℃保存备用。

GC-MS条件：根据唐超等[3]试验方法稍作调整，初始温度40 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升温至260 ℃，保持1 min，再以15 ℃/min升温至280 ℃，保持10 min；气化室温度250 ℃；离子源温度300 ℃；进样口温度280 ℃；载气为高纯度氦气；体积流量：1.0 mL/min；离子化模式：EI；电子能量：70 eV；溶剂延迟：12 min。质谱扫描范围：m/z 40～500。

2.2.2 羽扇豆醇定性及半定量分析 通过LC-MS检测，对相同工艺提取的GC-MS检测结果峰面积进行等量代换，并对LC-MS检测的其他峰面积进行推导计算含量(M：浸膏总重；Y：称取重量)。

3 结果

3.1 LC-MS检测单因素分析 LC-MS检测结果计算含量显示，羽扇豆醇在10倍液料比情况下比较溶剂与浸提时间2个因素。石油醚、浸提5 d、10倍液料比情况下羽扇豆醇含量最高。见表2。

表2 单因素实验结果

3.2 GC-MS检测正交试验分析

3.2.1 定性分析 如图1所示羽扇豆醇标准品A(18.37)与样品B的保留时间大致相同，向样品中加入标准品后出峰时间C(18.29)稍有提前。

表3 GC-MS半定量推导含量

采用中位数检验，正交实验排除第27号工艺后，对剩下26份数据按照羽扇豆醇含量降序排列，若数据为偶数，则中位数选取最中间2个数据(即第13号和第14号)，求得其平均值，即中位数值为4 503.66 μg；工艺分别为95%乙醇、15 d、10倍液料比和95%乙醇、10 d、5倍液料比。根据降序排列可以看出最大提取含量工艺为石油醚，5 d、5倍液料比，最小值为95%乙醇、5 d、5倍液料比。且羽扇豆醇含量前25%基本均为石油醚作为溶剂所提取的工艺。

表4 LC-MS与GC-MS相同工艺下羽扇豆醇峰面积及含量

表5 LC-MS与GC-MS相同工艺检测结果Wilcoxon符号秩和检验结果

4 讨论

采用提取方法包括水浴、热回流、超声、超临界萃取等[12-16]，溶剂包括乙醇、甲醇、氯仿等浸膏中均检测出羽扇豆醇[14-15,17]。但在高婷[14]的研究提到对山楂采用超声提取羽扇豆醇，并对溶剂(氯仿、甲醇、80%乙醇)及用量与超声时间进行单因素考察发现，在40 mL氯仿中超声45 min时提取效果最佳；并在枸骨叶中提取羽扇豆醇也通过单因素考察了溶剂(氯仿、乙酸乙酯、甲醇)及用量与提取方法[18]，最后发现用20 mL甲醇在40 ℃水浴16 h后超声30 min时提取率最佳。本实验设计三因素三水平正交实验，对马棘种子提取羽扇豆醇的工艺进行研究，采用了溶剂(95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚)、时间(5 d、10 d、15 d)、液料比(5倍、10倍、20倍)3种因素对马棘种子进行提取率考察。以提取羽扇豆醇含量从大到小排序发现，其中含量前25%均为石油醚作为溶剂提取，但第27号样品因石油醚提取，导致油脂含量过高，羽扇豆醇无法准确被检测。初步确定最佳工艺为石油醚、5倍液料比浸提5 d。但石油醚具有毒性，且难以回收，考虑对环境污染，及工业化大生产，不作为优选考虑的溶剂。排除石油醚对应的组别后，乙醇与乙酸乙酯相互交替，未见明显区别。根据单因素实验中采用95%乙醇提取，基本比乙酸乙酯作为溶剂提取率更高，且乙醇易回收，因此选取95%乙醇作为溶剂，在比较正交实验中，也同时与单因素实验结果相联系。综合上述考虑后得出马棘提取羽扇豆醇工艺为95%乙醇、15 d、10倍液料比。

此外，对于LC-MS与GC-MS检测结果的比较，在对肝脏及血清样本的分析中，GC-MS比LC-MS多分离鉴定出50%的化合物[19]。且在检测生物检材中甲基异柳磷在LC-MS对样品的处理比GC-MS检测更为烦琐[20]。对丙烯酰胺的含量检测中发现GC-MS/MS和LC-MS/MS 2种方法都具有定量限低、精密度好的特点[21]。但在相关文献中并没有对2种检测方法结果的比较。而本实验采用了在相同工艺下的样品，用LC-MS所测的含量与GC-MS峰面积进行比较，推导其GC-MS所测羽扇豆醇的含量计算公式，以计算正交实验中羽扇豆醇含量的方法。本实验首次尝试了对LC-MS与GC-MS所测实验结果进行比较及推导的方法，所计算结果没有统计学意义(P>0.05)，但不同溶剂间对应的比值有所差异。GC-MS一般是定性某成分的有无，不作为定量依据，其优点是一次检测可以获得很多种物质的信息，其缺点是定量不准确。LC-MS值一般是作为定量依据，其优点是定量准确，其缺点是1次只能检测1个成分的含量。从本实验看，GC-MS的峰面积值似可以与LC-MS进行大体含量推导。这为初步判断GC-MS峰面积值提供了一个便捷方法，值得进一步积累数据，找出规律。