TcYellow-h基因过表达参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性形成

2022-09-09陈二虎孟宏杰唐培安

中国粮油学报 2022年7期

陈二虎，孟宏杰，陈艳，宋伟，唐培安

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心；江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)隶属鞘翅目，拟步甲科，拟谷盗属，是一种全球广泛分布的重要储粮害虫，在我国大部分地区均有发生，严重危害玉米、稻谷、小麦、大豆以及薯干、酒曲、豆饼、药材、油菜等[1]。赤拟谷盗具有食性复杂、繁殖能力强、分泌有毒物质等特点，在农产品储运过程中一旦局部发生便会造成严重经济损失[2]。磷化氢(PH3)是储粮害虫防治的重要熏蒸剂，由于长期施用，已导致赤拟谷盗、锈赤扁谷盗(Cryptolestesferrugineus)、谷蠹(Rhyzoperthadominica)等害虫对其产生不同程度抗药性[3-5]，影响了粮食仓储[6]。因此，开展磷化氢抗性机制研究，避免和延缓磷化氢抗性发展，对磷化氢的可持续利用具有参考价值。磷化氢可通过呼吸作用进入昆虫体内，进而降低线粒体膜电位，抑制氧化呼吸反应，引起虫体内活性氧(ROS)水平显著提升，导致氧化损伤，最终造成昆虫死亡[7]。因此，可通过控制昆虫线粒体及呼吸代谢相关基因的表达水平来降低呼吸速率，进而减少熏蒸剂的吸收[8]。已有研究发现赤拟谷盗和谷蠹磷化氢抗性品系的呼吸速率显著低于敏感品系[9, 10]，线粒体重要的二聚体酶二氢硫辛酰胺脱氢酶基因突变已被证实参与介导谷蠹和赤拟谷盗对磷化氢高水平抗性的形成[11]。此外，研究发现众多解毒代谢相关基因，包括细胞色素P450、羧酸酯酶(Carboxylesterases)、谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferases)等均在储粮害虫磷化氢抗性品系中显著高表达[12-15]。本课题组前期研究结果显示P450酶活性的提高参与介导赤拟谷盗磷化氢抗性，进一步干扰过表达的P450基因，昆虫对磷化氢敏感性显著增强，证实解毒代谢反应亦参与储粮害虫磷化氢抗性形成[14, 15]。昆虫表皮覆盖于虫体外表面，具有承担外骨骼的功能，起防御外界不良环境如病原体、杀虫剂等侵袭的作用，是昆虫适应复杂自然环境的重要保护器官[16]。昆虫可通过改变表皮结构和成分，降低表皮穿透性来阻止或减少杀虫剂进入虫体，进而形成抗药性，因此表皮穿透性是昆虫抗药性形成的机制之一[17]，其是否参与磷化氢抗性形成鲜见报道。研究人员已通过高通量转录组测序发现表皮相关基因TcYellow-h在赤拟谷盗磷化氢抗性品系中显著高表达，预示其可能与磷化氢抗性相关[12]。本实验以危害严重且抗性发展迅速的储粮害虫赤拟谷盗为研究对象，综合运用生物测定、RT-qPCR、RNA干扰等技术明确昆虫磷化氢抗性与表皮相关基因的关系，进而为储粮害虫的抗性治理提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

选用5个不同地理种群的赤拟谷盗，分别采自江苏(JS，抗性倍数为1.7)、云南(YN，抗性倍数为3.0)、湖南(HN，抗性倍数为20.2)、四川(SC，抗性倍数为395.4)和广东(GD，抗性倍数为862.7)，并在南京财经大学粮食储运研究室培养数代并形成稳定的实验室种群。在实验室内以人工饲料(全麦粉∶酵母粉=19∶1)，在恒温(29～31) ℃、相对湿度为70%～80%、无光照的恒温恒湿培养箱中饲养。

1.2 生物信息学分析

从Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得赤拟谷盗表皮相关基因TcYellow-h(LOC660892)的核苷酸序列，用NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)预测该基因的完整开放阅读框(ORF)。分别使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)在线软件预测TcYellow-h蛋白的信号肽及保守的特征序列。

1.3 不同组织基因表达模式分析

不同组织样本收集，在冰上解剖羽化后7日龄的赤拟谷盗成虫30头(江苏种群为试虫)，分别在加有Trizol的无菌离心管中收集足量的不同组织部位表皮(头、胸、腹)、翅、足、肠道、马氏管、脂肪体，并置于液氮中冷冻保存备用。每个样本均设3个生物学重复。参照Trizol试剂说明书提取样品的总RNA(RNA浓度约为500～600 ng/μL)，接着利用RQ1 Rnase-Free Dnase去除基因组DNA。用核酸浓度测定仪测定RNA的浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳观察条带情况，以便进行后续实验。以RNA为模板(约1 000 ng)，依据HiScript©ⅡstStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒说明书进行反转录合成第一链cDNA，并于-20 ℃冰箱中保存备用。

根据1.3节中获得的序列信息，利用Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计赤拟谷盗TcYellow-h的特异性RT-qPCR引物(表1)，同时选择赤拟谷盗RPS18(XM_968539)和RPL13(XM_969211)作为定量实验的内参基因[14, 15]。按照ChamQTM SYBR©qPCR Master Mix (Low Rox Premixed)试剂盒说明书，使用ABI 7500 PCR系统进行RT-qPCR分析。该反应为20 uL体系，包括ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low Rox Premixed)10 μL，上下游引物各1 μL，Template cDNA 2 μL和RNaes free water 6 μL。RT-qPCR程序包括，95 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，并进行40个循环，最后95 ℃延伸30 s。本实验共设置3个重复，并基于2-ΔΔCt的方法进行数据分析[18]。RT-qPCR采用单因素方差分析方法，平均值多重比较采用最小显著差异法(LSD)，柱形图中不同字母表示显著性差异(P<0.05)。

表1 引物序列

1.4 不同地理种群基因的表达模式分析

分别挑取正常饲养条件下不同地理种群(JS、YN、HN、SC和GD)的赤拟谷盗7日龄成虫5头，加入Trizol充分研磨，总RNA提取、cDNA合成、RT-qPCR实验以及数据分析均参照1.3小节，共设置3个重复。

1.5 RNA干扰

根据TcYellow-h的基因序列信息，设计带有T7启动子的特异性引物(表1)，并进行PCR扩增，参照T7 RNAi Transciption Kit TR102试剂盒说明书体外合成dsRNA。参照Huang et al(2019)的方法[14]，将200 ng dsRNA注射到赤拟谷盗(广东种群)蛹内(注射位置为蛹的腹侧第1节或者第2节)，以未注射组作为空白对照，注射dsGFP组作为阴性对照，每组试虫30头，设置3次重复。注射完毕后，置于培养箱中正常饲养，收集羽化第7天的赤拟谷盗成虫，并冻存于液氮中备用。参照1.3小节的方法进行总RNA提取、cDNA合成、RT-qPCR实验以及数据分析，并计算RNA干扰的沉默效率。

将TcYellow-h基因进行有效沉默后，对赤拟谷盗磷化氢敏感性进行检测。选取各处理组成虫试虫(50头，7日龄)，使用LC30的磷化氢浓度行处理；使用气密性注射器抽取磷化氢气体并注入熏蒸瓶内，摇匀后置于培养箱中密闭熏蒸(恒温29～31 ℃、相对湿度为(70%～80%)。熏蒸20 h，统计试虫死亡数，连续统计14 d(以毛笔轻碰虫体尾部，附肢无反应作为死亡判断标准)，每组实验3次重复。基因沉默效率及试虫死亡率均采用单因素方差分析方法，平均值多重比较采用最小显著差异法(LSD)，柱形图中不同字母表示显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 赤拟谷盗Tcyellow-h序列分析

根据ORF Finder分析，赤拟谷盗TcYellow-h(GeneBank登录号：XM_008198277.2)开放阅读框840 bp，编码279个氨基酸。SignalP 4.1信号肽预测结果显示，TcYellow-h不存在信号肽。氨基酸序列分析显示TcYellow-h在第159～448个氨基酸之间存在保守的major royal jelly protein domains(MRJP, pfam03022)氨基酸区域(图1)。

图1 赤拟谷盗TcYellow-h氨基酸序列结构分析

2.2 不同组织表达模式分析

针对TcYellow-h基因，其主要在翅组织中高表达，且与其他组织表达量差异显著(P<0.05)；在胸和腹部表皮组织和足中表达量相对较低；在肠道、马氏管、脂肪体中少量表达或几乎不表达。

2.3 不同地理种群表达量分析

TcYellow-h基因在不同地理种群赤拟谷盗的表达水平显示该基因表达水平随赤拟谷盗磷化氢抗性水平的增加呈现上调趋势，且TcYellow-h基因在极高抗种群(SC和GD)的表达量显著高于其他种群(P<0.05)。

2.4 基因沉默对赤拟谷盗磷化氢敏感性的影响

利用RNAi技术干扰TcYellow-h基因的表达，以分析该基因与赤拟谷盗磷化氢抗性形成的关系。基因沉默效率检测结果显示，dsRNA注射能有效降低目的基因的表达，且dsGFP注射组与空白对照组基因表达量均无显著差异，dsTcYellow-h注射组基因沉默效率为73.0%。TcYellow-h基因的表达量降低后，极高抗种群(广东，GD)试虫对磷化氢的敏感性显著增强，经磷化氢(LC30)处理后其死亡率较对照组均显著升高(P< 0.05)。dsTcYellow-h处理组试虫死亡率较对照组升高了32.22%，空白对照组和dsGFP处理组之间试虫死亡率均无显著差异(图2)。

注：柱形图表示平均值±标准差，不同字母之间表示显著性差异(P < 0.05, LSD法)，以dsGFP为阴性对照，以未处理组为空白对照。图2 赤拟谷盗TcYellow-h基因沉默效率检测及基因沉默后磷化氢的敏感性变化

3 讨论

储粮害虫对磷化氢的抗性问题日益严重，已经成为制约世界各国粮食储藏行业健康发展的主要问题之一[6, 19]。目前，美国、澳大利亚、巴西、印度、中国等众多国家发现赤拟谷盗对磷化氢产生了较高的抗药性[14, 20-22]。已有研究发现磷化氢可通过呼吸作用进入昆虫体内，且磷化氢抗性产生与储粮害虫呼吸和解毒代谢通路基因相关[7, 10, 11, 13]。磷化氢除通过呼吸作用进入虫体外，亦可通过扩散作用穿透表皮直接进入虫体，即当昆虫呼吸急促时，呼吸作用表现为主要吸收途径；而当昆虫呼吸作用逐渐减弱时，表皮穿透作用则上升为主要方式[23]，推测表皮穿透性直接影响昆虫对磷化氢的吸收，表皮相关基因TcYellow-h与磷化氢抗性形成可能存在联系。

TcYellow-h拥有典型的MRJP基序，属于昆虫yellow家族蛋白，且该家族基因在昆虫表皮鞣化(骨化和着色)过程中发挥重要作用[24]。赤拟谷盗不同组织表达模式分析显示，TcYellow-h基因主要在成虫外周组织高表达，该基因可能在昆虫表皮中发挥作用。RT-qPCR结果发现TcYellow-h基因表达量随赤拟谷盗抗性水平的增加而显著升高，类似地，在锈赤扁谷盗、温带臭虫(Cimexlectularius)、桃蚜(Myzuspersicae)、中华按蚊(Anophelessinensis)、致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)等昆虫中发现不同种类表皮相关基因在药剂抗性品系中显著高表达[25-29]。可见，TcYellow-h是赤拟谷盗表皮重要的结构基因，可能参与了磷化氢抗性的形成。

本实验利用RNA干扰技术验证TcYellow-h基因在赤拟谷盗磷化氢抗性形成过程中的作用。结果显示，当注射该基因的dsRNA后，TcYellow-h基因表达水平显著降低，且经磷化氢处理后，处理组害虫的死亡率显著高于对照组，表明基因干扰后赤拟谷盗对于磷化氢的敏感性显著增强。昆虫表皮鞣化反应是一个复杂的胞外过程，对于表皮的硬化和着色至关重要。有效沉默鞣化通路上的关键基因，如酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase)、多巴脱羧酶(DOPAdecarboxylase)、漆酶(laccase2)、yellow等基因后，昆虫表皮的着色、结构和厚度均受到显著影响[24, 30, 31]，暗示它们存在参与昆虫对于药剂表皮穿透抗性形成的潜力[32]。据此，通过本研究可得出表皮相关基因TcYellow-h与赤拟谷盗磷化氢抗性相关。