CCL2 高表达与低级别胶质瘤患者不良预后的相关性

黄志杰，马月龙，陈雅娟

（福建师范大学生命科学学院/细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室，福建 福州 350108）

低级别胶质瘤（low-grade gliomas，LGG）又称脑胶质瘤，简称胶质瘤，是起源于神经胶质细胞的神经上皮肿瘤[1]，具有进展快、预后差、复发率高、致死率高的特点。2021 年世界卫生组织将胶质瘤从Ⅰ级（最低级别）到Ⅳ级（最高级别）进行分类，LGG通常包括Ⅰ级胶质瘤和Ⅱ级胶质瘤[2]。LGG 约占原发性脑肿瘤的20%，典型的LGG 患者为年龄在30～40 岁的年轻人，多因癫痫发作而就医[3]。LGG 患者具有生存期长、自然病史长、弥散性生长、临床预后差异性大等特点，使得观察与积极干预的治疗决策至关重要。促使LGG 获得全面高效治疗的措施成为目前神经肿瘤学的研究热点。趋化因子是一类能够趋化细胞定向移动的小分子分泌蛋白，趋化因子配体2 [chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2]又名单核细胞趋化蛋白-1（monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1），是趋化因子中的一员，由于其在癌症免疫治疗中起着重要的作用[4]，因此成为趋化因子中CC 亚族的重要成员。CCL2 于1989 年从单核细胞中纯化和克隆得到[5]。研究表明，CCL2 不仅对单核细胞，还对巨噬细胞[6]、记忆T 细胞[7]、自然杀伤（NK）细胞都具有趋化活性，从而将这些细胞募集到组织损伤和炎症反应的部位[8]。CCL2 在许多类型的细胞中表达，这些细胞在外周循环和组织中的抗病毒免疫反应中具有重要作用[9]。近年来，关于趋化因子与癌症进展之间关系的报道日益增多。CCR2 是CCL2 在人体内发挥生物学效应的最主要受体。有研究发现[10]，CCL2-CCR2 在肿瘤细胞的增殖、侵袭、创造肿瘤微环境（TME）过程中具有多种作用。且已有研究表明，CCL2-CCR2 信号轴参与了包括乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、肺癌[13]、肝细胞癌[14]、胰腺癌[15]、膀胱癌[6]、鼻咽癌[16]和肾癌[17]的发生和进展。因此，许多临床研究已将CCL2-CCR2 轴确定为早期诊断和不良预后的预测依据[18]。同时也有研究在人脑胶质瘤细胞系中趋化因子的表达中检测到CCL2 信使RNA[19]。但目前CCL2 在LGG 进展中的具体作用机制以及预后价值尚缺乏相关的研究报道。本研究主要关注CCL2 在LGG 中的表达及预后，同时研究CCL2 共表达基因网络，分析其在LGG 中的潜在作用机制，构建CCL2 相关基因的LGG 患者预后模型，旨在为LGG 临床预后诊断提供支持。

1 资料与方法

1.1 CCL2 基因表达分析 基于GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）的TCGA 癌症数据分析LGG 组织与正常组织中CCL2 基因的mRNA 表达差异（http://gepia.cancer-pku.cn/）。其中LGG 组织样本有518 例，正常组织有207 例。|log2FC≥1|和P＜0.05 被认为存在显著性差异。

1.2 CCL2 基因生存分析 下载TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）中的LGG 样本信息，使用R包“survival”进行CCL2 表达的生存分析，并通过“survivalROC”分析ROC 曲线。其中用于生存分析具有完整临床信息的样本有506 例。对数秩检验P值（Log-rankP）＜0.05 被认为存在显著性差异。

1.3 加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）使用R 语言中的“WGCNA”包进行分析。选择β=5 的幂和无标度R2=0.95作为软阈值参数，构建共表达基因网络。

1.4 CCL2 相关基因功能富集分析 为了进一步分析CCL2 共表达基因的潜在功能，本研究利用DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）数据库进行KEGG 通路分析和GO-BP 功能富集分析。

1.5 预后模型构建 通过TCGA 数据库中的LGG 数据，应用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）构建CCL2 相关基因特征。一个CCL2 相关基因特征的风险评分公式是通过包括由其LASSO Cox 系数加权的个体归一化基因表达值来建立的：∑iCoefficient（mRNAi）×Expression（mRNAi）。

1.6 统计学分析 使用t检验分析LGG 与癌旁组织中CCL2 基因的差异表达。P＜0.05 被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCL2 在LGG 组织中的表达与LGG 患者预后相关性GEPIA 网站分析 CCL2 在LGG 患者组织及正常组织中的表达差异，结果显示CCL2 在LGG 患者组织中的表达显著高于正常组织（图1A）；TCGA 数据库中的LGG 患者样本进行生存分析，结果显示CCL2 高表达患者的生存时间显著低于CCL2 低表达患者的生存时间，见图1B。

图1 CCL2 在LGG 患者中的表达及预后分析

2.2 构建CCL2 基因的共表达网络 通过WGCNA 对TCGA 数据集进行分析，以分析LGG 组织中与CCL2 存在共表达关系的基因。结果显示与CCL2 存在共表达关系的有1333 个基因，属于blue module，见图2A、图2B。为进一步研究CCL2 共表达基因与肿瘤信号通路的关系，利用DAVID 网站对这些基因进行KEGG-pathway 及GO-BP 富集分析，KEGGpathway 结果显示，以上基因富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、结核、破骨细胞分化、金黄色葡萄球菌感染、用于IgA 生产的肠道免疫网络、Th17细胞分化、B 细胞受体信号通路、炎症性肠病（IBD）、T 细胞受体信号通路及PD-L1 在癌症中的表达和PD-1 检查点通路，见图2C。GO-BP 分析结果表明以上基因富集在防御反应、细胞活化、免疫系统过程的调节、对生物刺激的反应、免疫效应过程、免疫系统过程的正向调节、参与免疫反应的细胞活化、骨髓白细胞活化、T 细胞活化及T 细胞增殖，见图2D。

图2 WGCNA 鉴定CCL2 共表达基因

2.3 构建CCL2 相关基因的LGG 患者风险评分预后模型 利用Cytoscape 及MCODE 分析了1333 个CCL2 相关基因的蛋白互作网络。结果显示在1333个相关基因的蛋白互作图中与CCL2 存在互作的蛋白有55 个，见图3。

图3 MCODE 分析CCL2 的互作蛋白网络

2.4 构建CCL2 互作基因在LGG 中的Cox 单因素生存模型 为了建立CCL2 相关的LGG 患者的风险模型，对55 个CCL2 互作基因在LGG 中的预后进行Cox 单因素生存分析。结果显示有45 个基因与LGG患者预后相关，见图4A。

在这45 个基因中，通过LASSO Cox 回归分析进一步选择潜在的预后模型相关基因。基于10 倍交叉验证，选择值0.0066 作为λ 的最小标准见图4B，并且获得了31 个非零系数的基因，见图4C。基于具有非零系数的基因，根据每个基因表达的线性组合乘以LASSO 系数计算每个患者的风险评分（risk score）：（1.2573×MYD88）+（-0.1165×CCL19）+（0.1020 ×TNFRSF1A）+（0.0581 ×TLR3）+（0.3917 ×CCR5）+（-0.0110 ×TLR7）+（1.3521 ×FCGR2A）+（1.2823 ×IL18）+（0.1340 ×CD44）+（-0.2169 ×ITGAM）+（0.0312 ×CLEC7A）+（0.1311 ×CD80）+（0.1553×CD40LG）+（-1.099×CYBB）+（0.1760×PTPRC）+（0.0346 ×TLR1）+（0.1268 ×PDCD1）+（-0.6524×C3AR1）+（-0.0112× CD163）+（0.3862×ITGAX）+（-0.3563 ×LILRB2）+（-0.1905 ×ICAM1）+（1.1956 ×CD274）+（-0.2380 ×CCL2）+（-0.1926 ×CCR1）+（0.1894 ×IL10）+（-1.8321 ×CXCL12）+（0.3136×VCAM1）+（-1.3497×SPI1）+（0.2727 ×IL1A）+（-0.3267×CXCR4）。将患者按照人数平均分为高风险评分组和低风险评分组。生存分析结果表明，高风险评分与LGG 患者的不良预后相关，见图4D。

此外，进行时间依赖性ROC 分析，以评估CCL2相关基因的风险评分模型的区分能力。结果显示，1、3 和5 年生存率的AUC（ROC 曲线下面积）值分别为0.900、0.890 和0.860，说明该模型具有较好的预后区分能力，见图4E。

图4 基于LGG 中CCL2 相关基因的风险评分模型

2.5 风险评分相关的nomogram 构建 使用R 软件包rms，整合生存时间、生存状态和4 个特征（risk score、age、sex 和tumor grade）的数据，利用Cox 方法建立了nomogram，评估这些特征在LGG 样本中的预后显著性，见图5A。nomogram 的1、3 和5 年生存率的AUC 值分别为0.930、0.910 和0.888，显示该模型具有较好的预后区分能力见图5B。

图5 Nomogram 的构建及其ROC 曲线

3 讨论

CCL2 是趋化因子家族中研究最多的成员之一，并且已被证明是治疗各种疾病的潜在干预点[4]。近年来，越来越多的研究发现CCL2 在多种肿瘤的发生发展和预后中扮演着重要角色，其在肿瘤发展和进展中的一个重要的作用是它与肿瘤微环境中的各种正常宿主细胞的相互作用。CCL2 在血管内皮细胞中的高表达促进了肿瘤脉管系统的发育[20]，除了将巨噬细胞募集到各种癌症的肿瘤微环境中，还能够招募各种免疫细胞（如髓源性抑制细胞MDSCs 等）形成免疫抑制微环境，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视并支持肿瘤细胞增殖[10]。CCL2 在肿瘤微环境中对癌症生长、进展和转移中起重要作用。例如在三阴性炎性乳腺癌中，CCL2 过表达并通过激活Src 和Erk1/2 信号通路调节蛋白水解活性，从而导致侵袭和转移[21]。另有研究显示[22]，CCL2 在单核细胞诱导的前列腺癌细胞侵袭中充当介质，同时增加NF-κB 活性，二者都参与介导前列腺癌细胞的侵袭。一项对处于不同阶段的前列腺癌患者的研究显示，血清CCL2升高与骨转移有关，这表明使用血清CCL2 作为预后生物标志物的可能性。另有研究报道[23]，CCL2 在人类肝癌中过表达与肝癌患者的预后有关。

以上研究提示，肿瘤中异常表达的CCL2 可作为预后、诊断和靶向治疗的分子标志物。本研究利用生物信息学分析，重点关注CCL2 在LGG 中的表达及潜在功能分析，结果显示CCL2 在LGG 组织中的表达高于正常组织；生存分析结果显示，CCL2 的高表达患者的生存时间低于CCL2 低表达患者，表明高表达的CCL2 是LGG 患者的不良预后因素。同时进一步分析了CCL2 的共表达基因，获得1333 个共表达关系基因，并且在通路和功能分析的结果中显示，CCL2 的共表达基因主要富集在免疫信号通路，表明CCL2 主要参与LGG 进展中的免疫相关途径。此外，为了确定与CCL2 相关基因的蛋白互作关系，从1333 个基因中筛选得到55 个相关基因，在经过建模分析后，又从中获得了31 个非零系数的基因作为LGG 预后分子标记物。根据风险评分模型将LGG 患者分为低风险组和高风险组，同时生存分析结果表明，高风险评分与LGG 患者的不良预后呈现相关性。

随着生命科学和计算机科学的迅猛发展，生物信息分析越来越多地被用于筛选与肿瘤预后相关的分子标志物。综上所述，CCL2 高表达与LGG 预后不良密切相关，是评估LGG 预后的有效指标，本研究成功构建用于评估LGG 患者预后的CCL2 相关基因预后模型。