生长阻滞特异性蛋白6表达与胎儿生长受限的相关性分析*

张奕梅，覃嘉怡，宋鹏书，潘平山

(广西壮族自治区妇幼保健院产科，南宁 530003)

胎儿生长受限(FGR)是指子宫内生长的胎儿的大小和重量减少，其发生率为所有妊娠的5%～10%。与正常发育的胎儿相比，FGR胎儿的围生期死亡率至少增加了10倍[1]。FGR是产科常见并发症之一，不仅出生时FGR婴儿有更高的胎儿窒息和神经发育障碍的风险，而且儿童期及青春期体能和智能发育均受影响，成人后更易发生代谢综合征[2]。FGR的成因大致可分为三大类：母体因素、胎儿因素和胎盘因素。胎盘因素是FGR最常见的病因之一，但其潜在机制尚不清楚[3]。 生长阻滞特异性蛋白6(Gas6)可表达于胎盘组织、内皮细胞等，是促进血管生成的因子。有研究发现Gas6可增强血小板脱颗粒，促进血小板聚集功能，从而介导血栓的形成，Gas6上调组织因子的表达，启动凝血过程[4]。

现临床有关胎盘Gas6水平检测在FGR患者产前诊断中的作用研究尚不多见，鉴于此，本研究通过探讨FGR患者胎盘Gas6的表达水平，寻找引起FGR的相关机制，为指导临床对FGR的预防、诊治提供一定的理论与临床依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2020年6月至2021年6月本院产科诊断为FGR孕妇50例作为试验组，同期选取50例妊娠正常孕妇作为对照组。纳入标准：(1)出生体重低于同孕龄同性别胎儿平均体重两个标准差或第十百分位数或孕37周后胎儿出生体重小于2 500 g；(2)胎龄大于或等于28周；(3)自然妊娠且单胎；(4)剖宫产终止妊娠。排除标准：(1)过期妊娠、多胎妊娠或胎儿畸形；(2)合并内、外科疾病，如阑尾炎、血液系统性疾病、高血压、糖尿病等；(3)胎盘肿瘤及胎盘血管瘤；(4)明确脐带因素导致的FGR；(5)明确胎儿染色体异常导致的FGR。本研究经本院伦理委员会批准，两组孕妇均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1资料采集

收集孕妇社会人口统计学资料(年龄、孕前体重、身高、教育程度、职业、受孕方式等)和生活习惯(孕期是否抽烟、饮酒等)。记录孕前体重指数(BMI) 、脐血流S/D值和妊娠期并发症。待分娩后，从住院病历系统收集母婴结局资料。

1.2.2实验试剂

Gas6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，ml060423,ml038196)、多聚甲醛固定液(美国Sigma公司，P-6148)、Gas6抗体(美国Abcam公司，ab223738)、TRIzol、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒(美国ThermoFisher公司，15596026，4368813，A25742)等。引物由上海生工生物技术公司合成，见表1。

表1 合成引物

1.2.3胎盘组织病理学检查

取胎盘母体面中央约1 cm3组织块，用生理盐水漂洗血液，置于4%的多聚甲醛液中固定24 h。然后组织块脱水，行石蜡包埋，切成4 μm厚度薄片，放入37 ℃温水表面贴到载玻片上，再依次浸入二甲苯和梯度乙醇脱蜡。蒸馏水冲洗，将载玻片放入苏木精溶液中染色，流水冲洗，放入37 ℃温水中进行反蓝，晾干，中性树胶封固保存，显微镜观察HE染色情况。

1.2.4ELISA检测外周血Gas6表达

采集两组孕妇外周血3 mL，室温放置1 h 后4 ℃、3 000 r/min 离心 15 min，取上清液，使用对应的试剂盒通过ELISA检测两组孕妇血清Gas6的表达情况，所有操作均严格按试剂盒说明书进行。

1.2.5免疫组织化学(IHC)检测胎盘组织中Gas6蛋白的表达

剪取分娩胎盘母体面约1 cm3组织块，用PBS冲洗血液，置于4%的多聚甲醛液中固定24 h。然后组织块脱水，石蜡包埋，切成4 μm厚度薄片贴到载玻片上，再依次经过脱蜡，高压修复，3%双氧水中孵育和封闭。滴加一抗孵育过夜，二抗孵育20 min，DAB显色5 min。苏木素染色1 min，分化反蓝，梯度乙醇脱水，树胶封片，用电子显微镜观察阳性面积大小。

1.2.6qPCR检测胎盘组织中Gas6 mRNA的表达

取分娩胎盘母体面约1 cm3组织块，用PBS冲洗血液，将组织放在-80 ℃冰箱保存。根据TRIzol-Reagent试剂盒提取RNA，采用ND2000分光光度计测定RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，参照TaKaRa公司说明书进行qPCR。反应程序设置为95 ℃预变性3 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40个循环;72 ℃延伸2 min。以GAPDH为内参，每次检测设定3个复孔。根据PCR扩增曲线，得到每个样本的循环周期数(Cq值)，使用2-△△Ct法计算目的基因表达水平。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1一般资料

两组孕妇均无吸烟/饮酒史。试验组孕妇孕周、新生儿体重均明显少于对照组，脐血流S/D值、BMI值、羊水过少发生率、妊娠期并发症发生率、胎儿窘迫、急诊剖宫产率均明显大于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组孕妇一般资料比较

2.2胎盘组织病理学检查结果

对照组胎盘组织内部细胞排列整齐，绒毛组织几乎无破损。试验组胎盘组织内部出现细胞溶解，血管有水肿破裂，绒毛间质纤维化及纤维蛋白样坏死，滋养层细胞肿胀，排列混乱，见图1。

A:对照组；B:试验组。

2.3外周血Gas6表达水平

对照组孕妇外周血Gas6表达水平为(9.60±2.52)pg/mL，试验组为(12.55±2.34)pg/mL。试验组孕妇外周血Gas6表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4胎盘组织中Gas6蛋白表达情况

与对照组比较，试验组胎盘组织中Gas6蛋白的棕色阳性区域表达水平明显上升，见图2。

A:对照组；B:试验组。

2.5胎盘组织中Gas6 mRNA表达情况

对照组胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平为1.03±0.04，试验组为1.41±0.23。试验组胎盘组织中Gas6 mRNA表达水平较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

FGR的发生是由于胎盘功能的损害，胎儿没有达到其宫内生长和发育的标准[5]。FGR是围生期死亡的第二大原因，造成30%的死产婴儿，也是早产和产时窒息的最常见原因。美国妇产科学院将FGR定义为胎龄低于10%的胎儿体重，并指出其与胎盘循环障碍有关[6]。胎盘循环障碍多与胎盘发育异常密切相关，FGR患者的胎盘多存在血管病变、胎盘血液循环阻力过高，导致胎盘血液循环受阻，胎盘血流量降低，引发严重胎儿缺血、缺氧、死亡的不良结局[7]。

本研究发现FGR患者的胎盘组织内部血管破裂溶解，绒毛间质纤维化及纤维蛋白样坏死，滋养层细胞肿胀，排列混乱，说明FGR患者的胎盘组织中血管压力过大导致组织损伤出现纤维化状态。纤维化是由于重复的组织损伤和修复过程失调而导致细胞外基质过度沉积的结果。Gas6基因是一种维生素k依赖的生长因子，表达于许多细胞类型，包括血管平滑肌细胞、系膜细胞和内皮细胞[8]。BELLAN等[9]指出Gas6在炎症控制和纤维化疾病进展中扮演了重要角色，推测Gas6可能成为减少纤维化损伤的潜在治疗靶点。有研究发现Gas6也在血小板中表达，可以加强血小板脱颗粒，促凝聚，促进血栓形成[10]。一项Gas6 抗体抑制血小板功能研究表明，Gas6 特异性抗体能有效作用于 Gas6 蛋白结构中负责将其与受体结合的C端，从而抑制血小板的活化[11]。陈宣辰[12]发现Gas6可能通过调节炎性反应、肾功能损害、脂肪形成、血管生成以及血栓形成参与子痫前期的发生、发展。FGR患者的胎盘多存在血管病变、循环阻力过高等问题，导致胎盘血液循环受阻，胎盘血流量降低，导致FGR，随着胎盘血液循环阻力的不断升高，可引发严重胎儿缺血、缺氧、死亡的不良结局[13]。为了验证Gas6因子与FGR患者发病存在相关性，本研究收集了FGR患者分娩前的外周血和分娩后的胎盘组织，检测了Gas6在其中的表达水平与正常孕妇相应表达水平的差别，结果发现Gas6分子表达与FGR存在相关性，Gas6在FGR患者外周血和胎盘组织中均高表达，可以初步推断Gas6分子在FGR发病和疾病发展中存在一定的协同作用。

为了明确FGR症状发生危险性及其发生机制与胎盘组织病理的相关性，本研究收集了FGR孕妇与健康孕妇的一般资料和妊娠期情况进行比较，结果显示，FGR孕妇脐血流S/D值、BMI值均明显高于健康孕妇，说明FGR孕妇机体本身出现了异样，如羊水量较少，发生妊娠期高血压、妊娠期糖尿病和严重贫血，这些并发症也均与胎盘发育异常有关。羊水量的多少反映胎盘的功能，羊水过少与宫内慢性缺氧导致胎儿体内的血液重新分布，使得胎儿肾脏血流量下降，所生成的尿液减少有关[14]。脐血流S/D值增加后外周小动脉阻力增加、小动脉发生痉挛，使得胎盘螺旋小动脉的血容量减少，引起胎盘缺血、缺氧和灌注不足、胎盘绒毛膜坏死梗阻均会导致妊娠期高血压[15]。所以胎盘组织中血管的损伤病变均会导致胎儿对营养物质和氧气摄入不足而发生FGR。

目前，已知胎盘及脐带、胎儿遗传性疾病等与FGR的发病密切相关，但其作用机制复杂，与FGR的关系尚未明确。Gas6有抗血管生成的作用，导致血流供应受阻，本研究中FGR孕妇外周血检测Gas6表达水平高于正常孕妇。本研究总结，Gas6可以与超声检测指标、临床诊断相结合，发挥其辅助诊断作用才能有效提高FGR的早期诊断效率。