抗逆转录病毒药对孕育期雌鼠心血管影响*

余海娟，陈祖盛，陈 彤，吴燚晶，孙珂悦，李昱静，徐 钦，叶寒辉，陈雅红，阮琴韵，傅丽云，黄春燕，周琳瑛，汪敏华，方秋娟△

（1.福建医科大学基础医学院生理学与病理生理学系心血管病离子通道信号调控福建省高校重点实验室，2.临床医学部，3.护理学院，4.孟超肝胆医院，5.附属第一医院超声科，6.公共技术中心电镜室，福建 福州 350108；7.福建中医药大学附属第二人民医院妇产科，福建 福州 350108）

艾滋病（获得性免疫缺陷综合征，acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是感染人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的人类免疫系统功能缺陷。HIV通过母婴传播已造成全球320多万15岁以下的儿童罹患艾滋病［1］。对HIV阳性孕产妇施行抗病毒联合治疗（又称高效抗反转录病毒治疗，highly active antiretroviral therapy，HAART），可显著降低HIV母婴传播，改善HIV阳性母亲预后［2，3］。而HAART药物长期使用可引发包括心血管系统损伤等不良反应，制约着HIV母婴阻断的安全和成败［4］。本研究参照《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》［5］，采用“齐多夫定（AZT）+拉米夫定（3TC）+克力芝（LPV/r）”HAART方案，观察孕育期雌性大鼠AZT+3TC+LPV/r灌胃3个月对存活、体重、血脂、血糖、心肌酶、肝酶及心血管功能结构影响，评价HAART对孕育期雌性大鼠的心血管不良反应，为临床HIV孕产妇心血管疾病监测、干预提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级SD大鼠25只，其中9周龄雌鼠19只，10周龄雄鼠6只，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（闽）2016-0002。

1.2 仪器与药品

RM6240BD型多道生理信号采集处理系统、压力换能器YPJ01H型（成都仪器厂），酶标仪Elx800（Bio Tek公司），GE VIVID E95彩色多普勒超声诊断仪（美国GE公司）；克力芝（AbbVie Ltd Maidenhead，SL6 4XE，英国），齐多夫定（东北制药集团沈阳第一制药有限公司），拉米夫定（上海迪赛诺生物医药有限公司）；甘油三酯（triglyceride，TG）、肌酸激酶（lactate dehydrogenase，LDH）、葡萄糖（glucose，GLU）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r实验模型制备

将9只/10只雌性大鼠与3只雄性大鼠合为1笼，共2笼，分对照组（CON）、AZT+3TC+LPV/r组（HARRT）。两组雌性大鼠于受孕前同时开始给药。每组雌性大鼠早、晚固定时间各灌胃1次，其中CON组雌性大鼠灌生理盐水（NS，10 ml/kg）；HAART组雌性大鼠灌等容积药物（含AZT 31.25 mg/kg+3TC 15.63 mg/kg+LPV/r（41.67/10.42）mg/kg）。每天测定体重，连续3个月。

1.4 雌性大鼠受孕情况判断

将待检查的雌鼠置于操作台上（避免尚未检查的雌鼠受其影响），轻柔安抚雌鼠，拇指和食指捏住其尾巴，其余三指轻压其后腰背部。翻起尾巴露出外阴，清理粪便后用生理盐水润湿的无菌棉签轻触阴道口，如发现有乳白或淡黄色固态栓状物即为阴栓，有阴栓者即交配成功，记为妊娠第“0”日。交配成功的雌鼠于妊娠第14日进行孕中期腹部触诊。孕中期在双侧腹部触及多个花生米大小、质韧、可推动、成串珠状排列的组织团块即为胚胎，为受孕成功的标志。

1.5 雌性大鼠心脏超声检查

雌性大鼠饲养12周后，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉，采用GE VIVID E95彩色多普勒超声诊断仪，测量左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVDd）、室间隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）、左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、主动脉窦部（sinus of aorta，AOD）、左房前后径（left atrial diamete，LAD）及射血分数（ejection fraction，EF）并记录连续3个完整心动周期的二维图像。另外于标准心尖四腔心切面取二尖瓣口血流速度频谱和二尖瓣环间隔、侧壁的组织速度多普勒频谱。

1.6 雌性大鼠动脉血压检测

雌性大鼠氨基甲酸乙酯（1 g/kg）腹腔注射麻醉，右颈总动脉插管，经RM6240BD型多道生理信号采集处理系统描记动脉血压，测心率（heart rate，HR）、收缩压（systolic pressure，SP）、舒张压（diastolic pressure，DP）、平均动脉压（mean arterial pressure，Pmean）、脉搏压（pulse pressure，PP）。

1.7 雌性大鼠左心室内压检测

雌性大鼠左心室插管，经RM6240BD系统描记大鼠左心室压力波，测心率（HR）、左心室压力最大上升速度（LVP+dp/dtmax）和最大下降速度（LVPdp/dtmax）。

1.8 雌性大鼠血清生化指标检测

雌性大鼠腹主动脉取血，按试剂盒说明，测甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein，LDL）、总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、血糖（glucose，GLU）及肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳 酸 脱 氢 酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）、谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）含量。

1.9 雌性大鼠心肌组织Masson染色

取雌性大鼠心肌组织制备石蜡切片、脱蜡、降梯度浓度酒精中脱水、温水漂洗，经R1核染色液、R2浆染色液、R3黄色分色液、R4蓝色复染液染色，升梯度浓度酒精中浸泡，二甲苯透明后封片，在光镜下观察心肌组织纤维化程度并拍照。

1.10 雌性大鼠心肌细胞超微结构电镜观察

取雌性大鼠左心室心尖部心内膜下心肌组织，切成1 mm3大小。经固定、脱水、透明、浸蜡后，包埋在已装有包埋剂的多孔橡胶模版中，将包埋剂灌满，制成包埋块。包埋块定位后，保留需要电镜观察的部分，把其余部分削除，切片，定位。用醋酸铀染色，再用柠檬酸铅染色5～15 min，蒸馏水冲洗。在透射电镜下观察心肌细胞超微结构并拍照。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 两组雌性大鼠存活情况的比较

CON组雌性大鼠9只均存活；HAART组雌性大鼠10只存活6只，4只分别于第4、16、22、39日死亡。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r导致生存不良。

2.2 两组雌性大鼠受孕情况的比较

CON组9只存活雌性大鼠受孕8只，平均分娩子鼠8.8只，平均受孕天数37.2 d；与CON组比较，HAART组6只存活雌性大鼠均受孕，平均分娩子鼠9.8只，平均受孕天数36.8 d。

2.3 两组雌性大鼠体重变化的比较

与CON组比较，HAART组雌性大鼠初始一周体重减少（P＜0.05，图1），后期体重与CON组无明显差异，提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r早期不良反应导致体重下降。

Fig.1 Changes in body weight of female rats*P＜0.05 vs CON group

2.4 两组雌性大鼠心脏超声指标的比较

与CON组比较，HAART组雌性大鼠心脏左室舒张末期内径（LVDd）、室间隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）、左房前后径（LAD）均增加（P＜0.05，表1）。提示雌性大鼠孕育期施加AZT+3TC+LPV/r引起心室肌肥厚、心脏扩大。

2.5 两组雌性大鼠动脉血压的比较

与CON组比较，HAART组雌性大鼠心率减少、舒张压增加（P＜0.05）；收缩压、平均压增加，脉压减少，但无统计学意义（P＞0.05，表2）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r导致动脉硬化，血管阻力增大，舒张压升高。

Tab.1 Cardiac ultrasound index of female rats（±s）

Tab.1 Cardiac ultrasound index of female rats（±s）

LVDd：Left ventricular end diastolic diameter；IVST：Interventricular septal thickness；LVPWT：Thickness of left ventricular posterior wall；AOD：Sinus of aorta；LAD：Left atrial diameter；EF：Ejection fraction*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group

Group n LVDd（cm） IVST（cm） LVPWT（cm） AOD（cm） LAD（cm） EF（%）CON 8 0.73±0.04 0.13±0.01 0.14±0.01 0.39±0.02 0.40±0.03 78.98±6.30 HAART 6 0.77±0.03* 0.15±0.01** 0.15±0.01* 0.41±0.03 0.44±0.03* 77.46±4.51

Tab.2 Arterial blood pressure in female rats（±s）

Tab.2 Arterial blood pressure in female rats（±s）

SP：Systolic pressure；DP：Diastolic pressure；Pmean：Mean arterial pressure；PP：Pulse pressure*P＜0.05 vs CON group

Group n Heart rate（beats/min） SP（mmHg） DP（mmHg） Pmean（mmHg） PP（mmHg）CON 6 373±55 120±15 79±12 93±12 41±8 HAART 5 349±47* 127±7 95±17* 106±13 32±11

2.6 雌性大鼠左心室血流动力学指标的比较

与CON组比较，HAART组雌性大鼠左心室压力最大上升速度（LVP+dP/dtmax）减少（P＜0.01，表3）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r造成左心室收缩功能下降。

Tab.3 Hemodynamic parameters of left ventricle in female rats（±s，n=6）

Tab.3 Hemodynamic parameters of left ventricle in female rats（±s，n=6）

LVP+dP/dtmax：Maximum rise velocity of left ventricular pressure；LVP-dP/dtmax：Maximum fall velocity of left ventricular pressure**P＜0.01 vs CON group

Group Heart rate（beats/min）LVP+dP/dtmax（mmHg/s）LVP-dP/dtmax（mmHg/s）CON 358±54 14374±1873 -8535±1099 HAART 342±32 10806±2104**-8868±2355

2.7 雌性大鼠血清生化指标的比较

与CON组比较，HAART组雌性大鼠甘油三酯（TG）减少（P＜0.05）、血糖（GLU）增加（P＜0.05，表4）；肌酸激酶（CK）减少（P＜0.01）、谷草转氨酶（GOT）减少（P＜0.05，表5）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r导致营养不良、糖脂代谢紊乱。

Tab.4 The four lipids and blood glucose of female rats（mmol/L，±s）

Tab.4 The four lipids and blood glucose of female rats（mmol/L，±s）

TG：Triglyceride；T-CHO：Cholesterol；LDL：Low density lipoprotein；HDL：High density lipoprotein；GLU：Glucose*P＜0.05 vs CON group

Group n TG T-CHO LDL HDL GLU CON 8 0.70±0.30 2.31±0.45 0.20±0.16 0.86±0.22 10.90±4.05 HAART 6 0.45±0.11*2.48±0.32 0.10±0.05 0.82±0.13 15.75±4.51*

Tab.5 Serum myocardial enzymes and liver functional enzymes of female rats（±s）

Tab.5 Serum myocardial enzymes and liver functional enzymes of female rats（±s）

LDH：Lactate dehydrogenase；CK：Creatine kinase；GOT：Glutamic oxalacetic transaminase；GPT：Glutamic pyruvic transaminase*P＜0.05，**P＜0.01vs CON group

Group LDH（U/L）CK（U/ml）GOT（/karU）GPT（/karU）CON 254±175 1.83±0.83 27.97±10.33 45.87±20.38（n=8） （n=7） （n=6） （n=6）HAART 266±167 0.41±0.20**17.16±2.99*36.89±7.80（n=5） （n=6） （n=6） （n=6）

2.8 两组雌性大鼠心肌组织纤维化的比较

与CON组比较，HAART组雌性大鼠心肌组织蓝染显示增加，表明心肌组织胶原纤维多（图2，图3）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r造成心肌组织纤维化。

Fig.2 Myocardial tissues of different female rats in CONgroup（Masson×400）

Fig.3 Myocardial tissues of different female rats in HAART group（Masson×400）

2.9 雌性大鼠心肌细胞超微结构的比较

CON组雌性大鼠心肌细胞胞质浓密；肌原纤维排列整齐，Z线、肌小节明显，可见M线和明带、暗带；线粒体丰富，嵴致密；核膜完整，染色质清晰（图4）。与CON组比较，HAART组雌性大鼠心肌细胞胞质疏松；肌丝模糊，明带、暗带不清，可见灶性断裂、溶解、消失，胶原纤维增生；线粒体嵴稀疏，呈空泡样改变；肌浆网扩张（图5）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r造成心肌细胞超微结构损伤。

Fig.4 Ultrastructure of myocardial cells of female rats in CON group（×12.5K）

Fig.5 Ultrastructure of myocardial cells of female rats in HAART group（×12.5K）

3 讨论

艾滋病是威胁人类健康的重大传染性疾病。WHO报告显示，全球新发HIV感染中母婴传播约占9%，是HIV疫情增长的重要因素之一。HIV孕产妇在未加干预的情况下，HIV母婴传播的概率高达20%～45%。采用高效抗逆转录病毒治疗（HAART），此概率可降到2%以下甚至更低［6，7］。对HIV孕产妇HAART防止HIV母婴传播已成为专家共识［8］，但HAART药物不良反应不容忽视［9］。

HAART引发的多系统不良反应中，心血管系统病变最受临床关注。目前我国艾滋病免费抗病毒治疗药物主要有两类：逆转录酶抑制剂（如AZT、3TC）和蛋白酶抑制剂（如LVP/r），前者对线粒体有毒性，后者可致糖、脂代谢异常，两者都可引发心血管疾病（CVD）［10］。临床实践表明，与男性相比，HIV女性HAART导致的脂肪分布异常、贫血、CVD等不良反应更为常见。此外，妊娠期生理改变造成药物吸收、分布、代谢和排泄改变，影响HAART效果和不良反应，增加HIV女性孕育期CVD风险。临床观察也表明，与妊娠期未接受HAART的孕妇相比，HAART的孕妇因高血压病死亡的风险更大［11］。因此，需要评估孕育期女性HAART安全性、耐受性和潜在毒性，防止高血脂、高血糖和肝毒性等不良反应［12］，避免HIV孕产妇CVD风险，保障母婴健康。

本研究制备雌性大鼠孕育期AZT+3TC+LPV/r灌胃3个月实验模型，观察生存情况、体重、血糖、血脂、心肌酶、肝酶及心血管功能和结构变化，明确艾滋病的抗病毒治疗药物对孕育期雌性大鼠的心血管不良反应，可望为HIV女性孕育期CVD防护提供理论和实验依据。

本研究发现，与对照组相比，HAART组雌性大鼠4/10只分别于HAART第4、16、22、39日死亡，提示HAART造成孕育期雌性大鼠生存不良；HAART初始1周时孕育期雌性大鼠体重减少，这与HIV患者HAART初体重下降的变化一致，其机制可能与HAART药物的近期不良反应（如胃肠道反应）有关；雌性大鼠3个月时血糖增加，TG、CK、GOT减少，提示HAART造成孕育期雌性大鼠代谢紊乱、营养不良。临床实践也显示，第一代核苷逆转录酶抑制剂（NRTIs）（司他夫定、齐多夫定等）和一些蛋白酶抑制剂（PIs）（克力芝等）可影响HIV患者脂质代谢［13］，造成脂代谢紊乱，导致脂肪营养不良、皮下脂肪减少、内脏脂肪积聚、血脂异常（TG、LDL升高）、胰岛素抵抗、糖耐量异常等远期不良反应，导致HIV患者易伴发CVD［14］；此外，本研究显示，HAART组雌性大鼠动脉舒张压升高，说明HAART造成血管外周阻力增大。这可能与蛋白酶抑制剂（克力芝）脂代谢异常的远期不良反应，导致动脉粥样硬化有关［15］。本研究对雌性大鼠心脏超声、心脏血流动力学、心脏组织学及心肌细胞超微结构观察［16］，结果显示，雌性大鼠孕育期HAART导致心脏扩大、心肌肥厚，心脏收缩速度下降，心肌胶原纤维增加，心肌细胞线粒体、肌原纤维等超微结构损伤，说明HAART可致心脏结构和功能异常，心肌纤维化重塑［17］。这些变化也与临床HAART的HIV患者常见心脏功能障碍相一致［18］。有研究表明，HAART可引起血管内膜-中膜复合物厚度增加，并直接或间接诱发内皮功能障碍；此外，齐多夫定和拉米夫定单独或联合使用可造成肌内膜间隙增加、心肌细胞损失和心肌束减少［19，20］。

本研究观察表明，HAART对孕育期雌性大鼠生长、代谢、心血管结构和功能影响，与临床实践中观察到HIV孕产妇HAART不良反应一致［21-25］。证实艾滋病抗病毒药（AZT+3TC+LPV/r）可导致孕育期雌性大鼠心血管不良反应。因此，临床HIV孕产妇HAART过程中需要加强心血管疾病监测与防护，以确保母婴安全。