不同中药复方及不同提取方法提取液对小鼠耐缺氧作用的影响*

李婉玉，马慧萍，马趣环，石晓峰△，鲁艳梅，张朋朋，张家旭，董学凤，叶倩女

（1.甘肃中医药大学，兰州 730030；2.甘肃省医学科学研究院，兰州 730050；3.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院全军高原损伤防治重点实验室，甘肃 兰州 730050）

人体各器官对于氧气都有不同程度的需求，尤其以大脑和心脏耗氧量最多；当氧气吸收障碍或转化不足会引起一系列慢性疾病［1］，故有缺氧乃万病之源之说；进驻高原低氧环境或密闭空间作业的人员，以及患有心肺等疾病者，常处于缺氧状态，导致身体亚健康现象。为了提高人们的生活质量，开发提高缺氧耐受力的药物及保健食品，已成为研究关注的又一热点［2］。

复方红景天全方由可用于保健食品的红景天、黄芪和药食同源的黄精、枸杞子（别名：红耳坠）4味中药组成，方中各药均单独具有耐缺氧、抗疲劳活性［3-6］，其中红景天、枸杞子、黄芪是纯中药类和中药与营养素复方类提高缺氧耐受力保健食品中使用频次较高（前10位）的中药［2］。本课题组前期曾根据处方中各味药材的有效成分和化学性质，设计出红景天和黄芪先醇提，药渣与黄精、枸杞子2味药材进行水提的工艺，并用Box-Behnken响应面法［7］和多目标遗传算法［8］对其醇提、水提工艺进行优选，但是缺乏药效学验证的工艺好似无本之木，且红景天资源匮乏，现已不支持大规模的开发利用［9］，而黄芪、黄精和枸杞子资源丰富，质量优良，作为西北高原道地药材具有很大的开发潜力。为此，本实验设计以红景天或黄芪为主成分组成的不同中药复方，并用不同的提取方法制得提取液，评价不同中药组方及不同提取方法提取物对小鼠的耐缺氧作用，旨在优选中药组方及提取方法，为临床应用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂

红景天购自于陇南市惠康中药材有限公司，黄芪、黄精、枸杞子药材均购自兰州安宁杏林药材批发部，经甘肃省医学科学研究院石晓峰主任药师鉴定为正品。复方丹参滴丸（规格：27 mg×180丸，批号：190709）由天士力医药集团股份有限公司生产，BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：20201010）由北京索莱宝科技有限公司生产；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（批号：20201211）、超氧化物歧酶（SOD）试剂盒（批号：20201212）、谷胱甘肽（GSH）试剂盒（批号：20200930）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（批号：20200818）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20200831）均由南京建成生物工程研究所生产。

1.2 动物

SPF级雄性BALB/c小鼠180只，体重20～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2016-0006。动物饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院动物实验中心，使用许可证号：SYCK（军）2020-0040。饲养室温度恒定在25～27℃，每12 h明暗交替，实验动物维持正常的饲料喂养，适应性饲养3 d后开始实验，实验期间实验动物自由摄食进水。

1.3 仪器

YC-010型多功能提取浓缩回收机组，上海雅程仪器设备有限公司；HH-4型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；DGZ-76型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；CX-100快速开盖万能高速粉碎机，上海市晟喜制药机械有限公司；AE200型电子分析天平；全自动样品快速研磨仪JXFSTPRP-24，上海净信科技；Sigma 3K15低温离心机，德国Sigma净信公司；SpectraMax i3全自动荧光酶标仪，Molecular Devices公司。

1.4 实验组药物的制备

复方红景天醇-水提取组：依处方比例分别称取4味药材，将红景天和黄芪混合，加入14倍药材量的70%乙醇，回流提取138 min，同法提取2次［7］，过滤，滤液减压回收至无醇味；药渣与黄精、枸杞子共同水提，按料液比1∶10（g：ml）加水提取2.94 h，同法3次［8］，过滤，滤液与无醇味的醇提物合并，浓缩，浸膏于50℃烘干，得浸膏粉373.56 g，备用。

复方黄芪醇-水提取组：按上述方法和工艺条件操作，将黄芪先醇提，药渣与黄精、枸杞子混合共同水提，制得浸膏粉210.17 g，备用。

复方红景天水提取组：依处方比例分别称取4味药材，混合，按料液比1∶10（g：ml）加水提取2.94 h，同法提取三次［8］，过滤，合并滤液，浓缩，浸膏于50℃烘干，得浸膏粉323.14 g，备用。

复方黄芪水提取组：按上述方法和工艺条件操作，将黄芪、黄精、枸杞子混合共同水提，得浸膏粉188.31 g，备用。

给药前将各组浸膏粉按相应剂量用灭菌注射用水配制成溶液，备用。

1.5 分组及给药

将180只BALB/c小鼠随机分成6组（n=30），即空白对照组、复方丹参组、复方红景天醇-水提取组、复方红景天水提取组、复方黄芪醇-水提取组、复方黄芪水提取组。其中，空白组灌胃灭菌注射用水，复方丹参组给药剂量依人用剂量折算为0.15 g/kg；复方红景天醇-水提取组和水提取组给药剂量为3 g/kg；复方黄芪醇-水提取组和水提取组给药剂量为1.7 g/kg（复方红景天醇-水提取组和水提取组给药剂量依预实验确定；复方黄芪醇-水提取组和水提取组根据处方的比例和复方红景天醇-水提取组和水提取组给药剂量折算，以保持除红景天外的其余3味药的等量）；各组连续灌胃给药10 d，0.2 ml/10 g，每日一次，实验遵守相关伦理要求。

1.6 常压耐缺氧实验

各组小鼠于末次灌胃1 h后［10］，将小鼠放入装有5 g钠石灰的250 ml磨口瓶中，每瓶放一只。瓶底预先放一张滤纸用于吸收小鼠排泄物，预先在瓶口内部和瓶盖外沿均匀涂抹凡士林，放入小鼠后立即塞紧瓶盖（防止漏气）并开始计时，观察到小鼠呼吸停止，腹部不起伏终止计时，记录每只小鼠的存活时间，并计算存活时间延长率，延长率%=各给药组（死亡时间-开始时间）/空白组存活时间×100%。

1.7 亚硝酸钠中毒存活实验

各组小鼠于末次灌胃1 h后，腹腔注射浓度为24 mg/ml的亚硝酸钠溶液，注射剂量0.1 ml/10 g，注射完成后立即开始计时，观察到小鼠呼吸停止、无明显活动特征终止计时，记录每只小鼠的存活时间。

1.8 急性脑缺血缺氧实验

各组小鼠于末次灌胃1 h后，用锋利的手术剪自颈部逐只将小鼠断头，记录断头后小鼠张口喘气的次数；并取小鼠的脑组织，按照试剂盒说明书测定各组小鼠脑组织中T-AOC、SOD、GSH、CAT、MDA含量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 不同中药复方及不同提取方法提取液对小鼠常压耐缺氧存活时间影响的比较

与空白对照组相比，复方丹参组、复方黄芪醇-水提取组和水提取组均能显著延长小鼠常压耐缺氧存活时间（P＜0.01，P＜0.05），复方黄芪水提取组存活时间延长率（32.65%）优于阳性对照药复方丹参组（21.22%），与复方丹参组相比各组耐缺氧存活时间无明显延长；与复方红景天醇-水提取组相比，复方黄芪水提取组存活时间显著延长（P＜0.01）；与复方红景天水提取组相比，复方黄芪水提取组存活时间显著延长（P＜0.01），其余各组均没有统计学差异；与复方黄芪醇-水提取组相比，复方黄芪水提取组存活时间显著延长（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice under normobaric hypoxia（±s，n=30）

Tab.1 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice under normobaric hypoxia（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；△△P＜0.01 vs Compound Rhodiola alcohol-water extract group；▲▲P＜0.01 vs Compound Rhodiola water extract group；○○P＜0.01 vs Compound Astragalus alcohol-water extract group

Group Extration method Dose（g/kg） Survival time（min） Extension rate（%）Control - 28.65±1.32 -Compound Danshen 0.15 34.73±3.34** 21.22 Compound Rhodiola alcohol-water 3 30.51±1.41 6.49 Compound Rhodiola water 3 29.88±2.96 4.29 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 31.55±2.97* 10.13 Compound Astragalus water 1.7 38.00±2.12**△△▲▲○○ 32.65

2.2 不同中药复方及不同提取方法提取液对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间影响的比较

与空白对照组和阳性对照复方丹参组相比，不同中药复方及不同提取方法提取液对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间无明显延长，无统计学差异，各组间相互比较也无统计学差异（表2）。

Tab.2 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice poisoned by sodium nitrite（±s，n=30）

Tab.2 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice poisoned by sodium nitrite（±s，n=30）

Group Extration method Dose（g/kg）Survival time（min）Control - 17.50±1.35 Compound Danshen 0.15 17.54±1.07 Compound Rhodiola alcohol-water 3 18.15±1.85 Compound Rhodiola water 3 18.60±1.59 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 17.76±1.73 Compound Astragalus water 1.7 19.80±3.10

2.3 不同中药复方及不同提取方法提取液对小鼠急性脑缺血缺氧张口喘气次数影响的比较

与空白对照组相比，复方丹参组、复方红景天醇-水提取组、复方黄芪醇-水提取组及水提取组小鼠断头后张口喘气次数均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），但与阳性对照复方丹参组相比无统计学差异；与复方红景天醇-水提取组相比，复方红景天水提取组、复方黄芪醇-水提取组和水提取组均无统计学差异；与复方红景天水提取组相比，复方黄芪醇-水提取组结果无统计学差异，复方黄芪水提取组显著增加（P＜0.05）；与复方黄芪醇-水提取组相比，各组小鼠张口喘气次数均无明显增加（表3）。

Tab.3 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the number of openmouth gasping in acute cerebral ischemic and hypoxic mice（±s，n=30）

Tab.3 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the number of openmouth gasping in acute cerebral ischemic and hypoxic mice（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；▲P＜0.05 vs Compound Rhodiola water extract group

Group Extration method Dose（g/kg）Number of openmouth gasps Control - 9.29±0.95 Compound Danshen 0.15 12.57±1.13*Compound Rhodiola alcohol-water 3 12.43±0.79*Compound Rhodiola water 3 10.57±0.79 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 12.86±1.77*Compound Astragalus water 1.7 13.57±0.54**▲

2.4 不同中药复方及不同提取方法提取液对小鼠脑组织T-AOC、SOD、GSH、CAT、MDA影响的比较

与空白对照组相比，复方丹参组和复方黄芪水提取组T-AOC活性均显著增强（P＜0.01，P＜0.05）；复方红景天醇-水提取组和复方黄芪水提取组SOD活性均显著增强（P＜0.05，P＜0.01）；复方丹参、复方红景天醇-水提取组及水提取组、复方黄芪水提取组GSH活性均显著增强（P＜0.01）；复方黄芪水提取组CAT活性显著增强（P＜0.01），MDA含量显著降低（P＜0.01）。与阳性对照复方丹参组相比，各组T-AOC活性无明显增强，复方黄芪水提取组SOD、GSH、CAT活性均显著增强（P＜0.01，P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）。与复方红景天醇-水提取组相比，复方红景天水提取组、复方黄芪醇-水提取组和水提取组T-AOC活性均无明显增强；复方黄芪水提取组SOD活性显著增强（P＜0.05）；各组GSH、CAT活性均无显著增强，MDA含量无明显降低。与复方红景天水提取组相比，复方黄芪水提取组SOD活性均显著增强（P＜0.05），各组T-AOC、GSH、CAT活性均无明显增强，MDA含量无显著降低。与复方黄芪醇-水提取组相比，各组T-AOC活性均无明显增强，复方黄芪水提取组SOD、GSH活性均显著增强（P＜0.01，P＜0.05），CAT活性无明显增强，MDA含量显著降低（P＜0.05，表4）。

3 讨论

复方红景天全方由红景天、黄芪、黄精、枸杞子4味中药组成，是在民间验方的基础上经我省知名中医学者加减论证得来。其中药典收录的大花红景天Rhodiola crenulata（HK.f.et.Thoms）H.Ohba为景天科红景天属多年生草本植物，具有益气活血、通脉平喘的功效［11］。现代药理研究表明，其具有改善睡眠、生血活血、抗脑缺氧、抗疲劳、活血止血、清肺止咳、化淤消肿、解热退烧、滋补元气等多方面药理功能［4，12］，复方中黄芪为补气要药，配伍黄精、枸杞子补气养阴，滋阴润肺。中医认为缺氧属肺肾气虚、痰浊瘀阻，而复方红景天有益气滋阴的功效，因此可针对其开发耐缺氧保健品［2］。红景天历来为抗缺氧常用中药，是多种藏成药、中成药、食品、饮料和化妆品的重要原料，需求量大，但药材来源以野生资源为主，由于其生境独特、习性特殊、分布狭窄，常遭遇地毯式地采光挖净，面临种源断绝的危机，已被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物［12，13］。目前常用的耐缺氧类西药如乙酰唑胺等虽然疗效较好，但仍有较多副作用［14］。而耐缺氧、抗疲劳中药及复方作用效果好兼具补益功效且副作用较少［15］，值得深入研究。植物多糖具有较好的抗氧化、耐缺氧作用［16-18］。复方中黄芪、黄精、枸杞子等多糖含量较高，且红景天苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷等有效成分极性较大，适合用大极性溶剂提取。而水作为常用溶剂安全性较高，因此在前期醇-水提工艺的基础上考虑直接水提的方法。为此本实验设计小鼠常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验和急性脑缺血缺氧实验，在动物水平评价复方红景天及复方黄芪先醇提后水提和全方水提方法对药效的影响，以确定其处方是否可以剔除濒危药材红景天，为红景天的资源保护提供新的思路。

Tab.4 Effects of different herbal compound and extracts from different extraction methods on T-AOC，SOD，GSH，CAT and MDA in mouse brain tissues（±s，n=30）

Tab.4 Effects of different herbal compound and extracts from different extraction methods on T-AOC，SOD，GSH，CAT and MDA in mouse brain tissues（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs the compound Danshen Group；△P＜0.05 vs Compound Rhodiola alcohol-water extract group；▲P＜0.05 vs Compound Rhodiola water extract group；○P＜0.05，○○P＜0.01 vs Compound Astragalus alcohol-water extract group

Group T-AOC（U/mg prot）SOD（U/mg prot）GSH（mg GSH/g prot）CAT（U/mg prot）MDA（nmol/mg prot）Control 0.74±0.22 1.03±0.20 0.62±0.30 2.50±0.95 4.90±1.48 Compound Danshen 2.61±0.35** 1.20±0.24 1.45±0.18** 2.60±0.51 4.58±0.88 Compound Rhodiola 1.04±0.38 1.42±0.52* 1.53±0.36** 3.10±0.69 4.39±0.58 Compound Rhodiola 1.01±0.34 1.31±0.30 1.61±0.40** 3.20±1.14 4.34±1.42 Compound Astragalus 1.01±0.25 1.15±0.14 0.80±0.31 2.95±0.46 4.66±1.20 Compound Astragalus 1.05±0.23* 1.64±0.50**##△▲○○1.80±0.56**#○ 4.17±1.68**## 3.28±0.88**#○

为了保证药效结果的可靠性，参考文献方法［19，20］，本试验选用复方丹参滴丸作为阳性对照。实验结果表明，复方黄芪水提物可显著延长小鼠常压耐缺氧存活时间，且效果优于阳性对照药复方丹参滴丸；亚硝酸钠注射作为一种化学缺氧的方法，也可评价不同药物的耐缺氧作用。亚硝酸钠入血后，将正常的二价铁氧化成三价铁使红细胞失去载氧能力，最终使动物因缺氧死亡。本实验对小鼠腹腔注射亚硝酸钠后，各给药组小鼠存活时间没有明显延长，且死亡较快，分析原因可能是各药物组没有明显保护亚硝酸钠中毒的作用，也可能是亚硝酸钠浓度过高，毒性太强对小鼠造成的伤害无法恢复［20］。阳性对照药复方丹参滴丸、复方红景天醇-水提取物、复方黄芪醇-水提取物及水提物对小鼠断头后张口喘气次数较空白对照组均有显著增加，但与阳性对照药复方丹参滴丸比较无统计学差异。

缺氧诱发机体发生氧化应激反应，产生大量的自由基攻击机体细胞或组织，严重时引起机体器官损伤，产生病变［21］。大脑易受到缺氧的影响，本实验测定小鼠脑组织中的T-AOC、SOD、GSH、CAT活性、MDA含量，能够比较客观的反映各药物组在缺氧时对机体的保护作用。T-AOC、SOD、GSH和CAT作为重要的抗氧化物酶，其含量高低反映机体清除自由基和分解过氧化物的能力。MDA是脂质过氧化的产物，其含量高低能够间接反映细胞的受损程度［22］。与阳性对照药复方丹参滴丸组相比，复方黄芪水提物组小鼠脑组织除T-AOC活性有所下降外，SOD、GSH和CAT活性都显著增加，MDA含量显著下降，表明复方黄芪水提物组对缺氧引起的氧化应激有一定程度的保护作用。综合实验结果表明各给药组对缺氧引起的氧化应激均有不同程度的干预作用，可能是各药物组具有耐缺氧作用的机制之一。以上结果提示复方黄芪水提物的耐缺氧效果最好，原复方红景天全方可以剔除红景天由黄芪、黄精、枸杞子组成，其制备提取方法为水提。