柚皮素对人自然杀伤细胞杀伤肝癌细胞的影响及其机制

马利节， 于 畅， 王 芳， 唐亦非， 邬海龙， 孙学华， 高月求

1 上海中医药大学， 上海 201203； 2 上海中医药大学附属曙光医院 a.肝病科， b.中心实验室，上海 201203； 3 上海健康医学院， 上海 201203

肝细胞癌是当前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命健康[1-2]。肝癌治疗包括肝切除术、肝移植术、局部消融治疗、经肝动脉化疗栓塞术、放射治疗、全身治疗等多种手段[3]。然而由于肝癌患者早期症状不明显，多数确诊时已属中晚期，治疗效果差，病死率高[4]。因此，为提高肝癌患者的生存率，进一步寻找新的药物、生物免疫等治疗方法成为近年的研究热点。

柚皮素(4,5,7-三羟基黄酮)是一种类黄酮化合物，无色无味，主要存在于各种葡萄、浆果和柑橘类水果中[5]。柚皮素具有多种生物学作用，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤[6]等。其中，抗肿瘤活性是目前国内外研究的一个热点。有报道[7]提出柚皮素可增强自然杀伤(NK)细胞及细胞毒性T淋巴细胞活性，抑制巨噬细胞中的细胞氧化，从而发挥抗肿瘤作用。

NK细胞是固有免疫系统的效应细胞，通过杀死感染、入侵、应激或转化的细胞，保护宿主。此外，NK细胞通过细胞相互作用发挥抗肿瘤免疫反应。近年来，以NK细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗取得重大进展，包括NK细胞过继转移治疗、募集NK细胞至肿瘤微环境、阻断限制NK细胞功能的抑制受体等[8]。本实验探讨柚皮素对人NK细胞杀伤人肝癌细胞株CLC5活性的影响，并初步分析其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 淋巴细胞分离液购自CEDARLANE(加拿大)；注射用重组人白细胞介素2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)购自北京双鹭药业股份有限公司；柚皮素(纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜、青链霉素均购自美国Sigma公司；NK细胞培养基购自德国CellGro SCGM；CD56-APC、CD3-FITC购自美国BD公司；CellTiter-LumiTM、黑色96孔板均购自碧云天生物技术研究所；CCK8试剂购自大连美仑生物技术有限公司；流式细胞检测仪购自美国Becton Dickinso公司；SpectraMax iD5酶标仪购自美谷分子仪器(上海)有限公司；RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清、实时荧光定量PCR仪购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 人NK细胞的培养和鉴定 经知情同意，先后取3名健康志愿者外周抗凝血100 mL，分离单个核细胞(PBMC)。每100 mL外周抗凝血可分离约3×106PBMC，用含500 IU/mL rhIL-2的NK培养基调整细胞数为5×105/mL，接种于6个25 cm2培养瓶中。每瓶NK细胞培养基加至5 mL，于37 ℃、5% CO2培养箱培养，每2 d半量换液1次，维持细胞密度为 5×105/mL，收集培养扩增15 d的NK细胞，加入FITC标记的CD3、APC标记的CD56进行细胞表面标志检测[9]，流式鉴定重复3次。

1.3 CCK8法检测不同浓度柚皮素对肝癌细胞生长的影响 人肝细胞癌CLC5细胞(购自BRICS生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院质粒细胞库)，编号：BRICS0004，以含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基培养。将肝癌细胞配成5×104/mL的细胞悬液，100 μL/孔接种于96孔板，加入柚皮素(终浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每组设6个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱培养0、24、48 h后，每孔加入CCK8 10 μL，继续培养2 h后，于酶标仪450 nm处检测各孔吸光值(OD)并记录结果，同时计算肝癌细胞增殖率。肝癌细胞增殖率=[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。

1.4 CCK8法检测不同浓度柚皮素对NK细胞生长的影响 由于CCK8试剂对悬浮细胞染色较为困难，将NK细胞配成2×105/mL的细胞悬液；100 μL/孔接种于96孔板，加入柚皮素(终浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每组设6个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，每孔加入CCK8 10 μL，继续培养2 h后，于酶标仪450 nm处检测各孔OD值并记录结果，同时计算NK细胞增殖率。NK细胞增殖率=[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。

1.5 CellTiter-LumiTM法检测不同浓度柚皮素对NK细胞杀伤率的影响 胰酶消化肝癌细胞并计数，配成5×104/mL的细胞悬液，50 μL/孔接种于黑色96孔板；将NK细胞配成5×104/mL的细胞悬液，50 μL/孔同时接种于黑色96孔板，构建NK-肝癌细胞1∶1共培养体系，每组6个复孔；加入柚皮素(终浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)共培养24 h，取出细胞培养板室温平衡10 min，每孔加入100 μL CellTiter-LumiTM试剂，室温振荡2 min促进细胞裂解后，室温孵育10 min使发光信号趋于稳定，应用多功能酶标仪进行化学发光检测并记录Luminescence值。NK细胞杀伤率=[1-(共培养孔-NK细胞孔)/肝癌细胞孔平均值]×100%[10]。

1.6 实时荧光定量PCR法检测柚皮素对NKG2D受体及配体的影响 胰酶消化肝癌细胞并计数，配成1×105/mL的细胞悬液，1 mL/孔接种于6孔板；将NK细胞配成1×105/mL的细胞悬液，1 mL/孔同时接种于6孔板，构建NK-肝癌细胞1∶1共培养体系。柚皮素刺激24 h，收集细胞使用RNA快速提取试剂盒提取总RNA；使用逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录得到cDNA；SYBR Green实时荧光定量PCR法检测NK细胞中NKG2D受体及肝癌细胞中NKG2DL(MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达水平，采用2-ΔΔCt法计算各mRNA相对表达量。引物由上海擎科生物工程股份有限公司合成，信息见表1。

2 结果

2.1 人 NK 细胞培养及鉴定 研究[11-12]表明，人NK细胞表型为CD3-CD56+；收集3名健康志愿者经rhIL-2诱导的PBMC细胞进行流式检测，培养15 d后NK细胞占PBMC比例为82.33%±0.70%(图1)。

2.2 柚皮素对肝癌细胞的影响 柚皮素作用24 h后，所有浓度组CLC5肝癌细胞的增殖率均无明显差异(P值均>0.05)；48 h后3.125～50 μmol/L浓度组CLC5肝癌细胞的增殖率较0 μmol/L浓度组(642.76%±30.44%)均有所下降(P值均<0.000 1)，且具有一定的浓度依赖关系。其中，3.125 μmol/L柚皮素组即有明显抑制CLC5肝癌细胞增殖率(561.96%±42.84%)的作用(P<0.000 1)，50 μmol/L浓度组CLC5肝癌细胞增殖率(464.02%±13.15%)最低(P<0.000 1)(图2)。

注：a， NK细胞流式鉴定；b， 显微镜下NK细胞形态。

注：与0 μmol/L浓度组相比，P<0.000 1。图2 不同质量浓度柚皮素对肝癌细胞增殖率的影响Figure 2 Effects of different naringin concentrations onviability of hepatocellular carcinoma cells

表1 实时荧光定量PCR引物列表Table 1 List of primers for fluorescence quantitative PCR

2.3 柚皮素对NK细胞的影响 根据本实验研究目的，以及柚皮素作用24 h对肝癌细胞的增殖无明显影响，仅观察不同质量浓度柚皮素作用NK细胞24 h后，对NK细胞增殖率的影响。结果发现，柚皮素作用24 h后，3.125～12.5 μmol/L质量浓度组NK细胞的增殖率较0 μmol/L组均无明显差异(P值均>0.05)；25 μmol/L浓度组柚皮素NK细胞的增殖率(109.89%±1.93%)较0 μmol/L组(100.17%±1.88%)即有升高(P<0.000 1)，50 μmol/L浓度组柚皮素对NK细胞增殖的促进作用(118.29%±2.34%)尤为突出(P<0.000 1)(图3)。

注：与0 μmol/L浓度组相比，P<0.000 1。图3 不同质量浓度柚皮素对NK细胞增殖率的影响Figure 3 Effects of different naringin concentrations onviability of NK cells

2.4 柚皮素对NK细胞杀伤率的影响 柚皮素作用NK-肝癌细胞1∶1共培养体系24 h后，3.125～12.5 μmol/L质量浓度组NK细胞的杀伤率较0 μmol/L组均无明显差异(P值均>0.05)；25 μmol/L浓度组NK细胞的杀伤率(44.75%±3.25%)较0 μmol/L组(32.70%±3.68%)即有升高(P<0.000 1)，50 μmol/L浓度组对NK细胞杀伤率的提高(46.79%±3.54%)较25 μmol/L浓度组无明显差异(P>0.05)(图4)。

2.5 柚皮素对NKG2D受体及配体的影响 根据以上实验结果，以0 μmol/L柚皮素作为对照组，观察25、50 μmol/L浓度组柚皮素对NK细胞中NKG2D受体及肝癌细胞中NKG2D配体(NKG2D ligand, NKG2DL)表达的影响。结果发现，作用于NK-肝癌细胞1∶1共培养体系24 h后，25、50 μmol/L浓度组柚皮素对NK细胞中NKG2D受体的表达均无影响(P值均>0.05)，对肝癌细胞中部分NKG2DL(MICB、ULBP2)的表达亦无影响(P值均>0.05)；25、50 μmol/L浓度组可促进肝癌细胞中部分NKG2DL(ULBP1、ULBP3)的表达(P值均<0.001)。而25 μmol/L与50 μmol/L浓度组柚皮素对肝癌细胞中ULBP1和ULBP3表达的上调均无明显差异(P值均>0.05)(图5)。

3 讨论

近年来，中草药及其提取物在减少肿瘤治疗的副作用和改善免疫系统功能方面具有独特优势[13-15]，从而延长癌症患者的生存时间，提高生活质量。柚皮素在防治肿瘤方面的潜在作用引起广泛关注[16]。据报道，柚皮素可作为一种化学增敏剂，协同增强紫杉醇在前列腺癌细胞中的细胞毒作用[17]；并可与衣霉素BAY 11-7082结合有效诱导结肠癌细胞凋亡[18]。NK细胞是固有免疫的重要组成部分，是肿瘤细胞免疫治疗的基础[19-20]，NK细胞的抗肿瘤作用除了依赖其杀伤活性外，与其数量也有很大的关系。本实验结果表明，柚皮素作用于NK细胞24 h后，25 μmol/L质量浓度组NK细胞的增殖率逐渐上升，50 μmol/L时NK细胞增殖率达最高峰，提示一定浓度的柚皮素能够促进NK细胞的增殖，其具体机制尚不清楚。

注：a, CellTiter-LumiTM检测原理；b, 柚皮素对NK细胞杀伤率的影响。与0 μmol/L浓度组相比，P<0.000 1。

注：a, 柚皮素对NKG2D受体的影响；b, 柚皮素对NKG2DL的影响。

NKG2D是NK细胞和部分T淋巴细胞中的重要激活型受体。NKG2DL在大多数肿瘤细胞中特异性表达[21]。NKG2DL与NK细胞上的NKG2D结合将诱导细胞介导的细胞毒性从而破坏靶细胞。然而随着病程的进展，一些肿瘤细胞通过配体脱落、配体保留和诱导邻近细胞上的配体，以规避NKG2D介导的免疫监测，这表明了NKG2D/NKG2DL的相互作用在肿瘤免疫反应过程中的重要性，使NKG2D/NKG2DL在癌症治疗应用中具有巨大的潜力[22]。本实验结果表明柚皮素作用于NK-肝癌细胞1∶1共培养体系24 h，当浓度超过25 μmol/L时NK细胞的杀伤率较对照组上升，而25 μmol/L与50 μmol/L浓度组之间对NK细胞杀伤率的提高无明显差异。25 μmol/L与50 μmol/L柚皮素分别作用于NK-肝癌细胞1∶1共培养体系24 h，NK细胞中NKG2D的表达较之对照组无明显差异，CLC5细胞中ULBP1及ULBP3的表达较之对照组升高，即柚皮素通过暴露肝癌细胞中NKG2DL，使其与NKG2D结合而促进NK细胞杀伤作用。

综上所述，柚皮素不仅能够促进NK细胞的增殖，而且能够增加NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性，其机制可能与柚皮素上调肝癌细胞中ULBP1、ULBP3等NKG2DL的表达有关，但其具体作用机制还有待进一步深入研究，上述结论为柚皮素应用于肝癌的免疫治疗提供了理论依据。

伦理学声明：本研究于2018年11月20日通过上海中医药大学附属曙光医院伦理委员会审核批准，批号：2018-628-57-01。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：马利节、于畅负责课题设计，资料分析，撰写论文；王芳、邬海龙参与收集数据，修改论文；唐亦非参与修稿事宜；孙学华、高月求负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。