影响饲料中氨基酸含量测定的结果稳定性因素探讨
2022-09-08冯淑玲邱韵怡吴仕辉
冯淑玲, 邱韵怡,吴仕辉
(广东海大集团股份有限公司 农业农村部微生态资源养殖利用重点实验室,广东广州 511400)
蛋白质是饲料中主要的营养指标之一,而氨基酸是构成动物体内营养所需生物大分子蛋白质和多肽的基本单位。氨基酸种类非常多,但组成蛋白质的基本氨基酸约有20种。氨基酸含量的精准测定对饲养动物的营养配方精准设计至关重要。随着科技的发展,氨基酸分析方法根据原理的不同,可分为化学分析法、光谱法、色谱法和其他方法 (宋军,2020;杨苗苗,2018;贾铮等,2017) ,而采用茚三酮作为柱后衍生剂的离子交换色谱法则被公认为是这项技术的经典方法(杨欣卉和谢剑飞,2019;丁永胜和牟世芬,2004;AOAC Official Method 994.12),其专属检测设备氨基酸分析仪也因此得到广泛应用。国标GB/T 18246-2019饲料中氨基酸的测定采用的就是离子交换色谱——全自动氨基酸分析仪,其具有高灵敏度、高精密度、操作简单等优势。
除了设备的稳定性,前处理是引入误差的最关键因素。其中水解是氨基酸分析前处理中重要的一环,直接影响氨基酸分析结果的准确性。饲料中氨基酸以游离态和蛋白质形式存在,前处理酸水解的目的是为了水解肽键,将氨基酸水解成游离状态,其重点和难点是保证水解彻底完全且减少敏感氨基酸的损失。本实验选取高级鱼粉作为日常质控样品,样品经盐酸水解后,用氨基酸分析仪进行测定,通过收集质控数据,绘制质控图,并结合前处理过程中温度等监控手段,对可能影响结果稳定性的因素进行分析评价。旨在对氨基酸检测过程中存在的异常情况进行原因分析,找出检测过程中影响16种氨基酸含量准确性的关键因素,并进一步优化检测方法,提升方法的稳定性。
1 材料与方法
1.1 原理 饲料中的蛋白质在110℃,6 mol/L盐酸作用下,水解成单一氨基酸,利用氨基酸分析仪对各种氨基酸组分的结构、酸碱性、极性及分子大小的差异进行分析,经阳离子交换柱分离后采用不同pH离子浓度的缓冲液将氨基酸组分依次洗脱下来,再与茚三酮试剂混合,然后共同流至反应柱中,于135℃下加热,形成深兰紫色复合物,在570 nm有吸收峰;茚三酮与羟脯氨酸反应不释放氨 ,直接生成浅黄色复合物,在440 nm波长有最大吸收峰。
1.2 仪器设备 日立L-8900型氨基酸自动分析仪、分析天平(感量0.0001 g)、氮吹仪、恒温水浴锅、超纯水机、电热恒温鼓风干燥箱、样品粉碎机、多路温度巡检仪。
1.3 材料 质控样鱼粉粉碎后并过60目筛,混匀密封,保存于0~4℃冰箱,以保证质控样的相对稳定。
1.4 试剂 浓盐酸(广化GR)、苯酚(Sigma GR)、巯基乙酸(Sigma)、高纯氮气(≥99.99%)、16种氨基酸混合储备液(Sigma 2.5 μmol/mL)、实验用水(一级纯水)。
1.5 试剂配制 盐酸溶液(0.02 mol/L):以浓盐酸600倍稀释得到。盐酸水解溶液(6 mol/L):将500 mL浓盐酸与等体积水混合并加入1 g苯酚,混匀。不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液:按仪器说明书配制。茚三酮溶液:按仪器说明书配制。氨基酸混合标准工作液(0.1 μmol/mL):吸取1 mL 2.5 μmol/mL标准储备液,用0.02 mol/L盐酸定容至25 mL;分装备用。
1.6 样品前处理 准确称取0.06~0.08 g(精确至0.0001 g)样品于25 mL水解管中,加入6 mol/L盐酸15 mL,加入巯基乙酸3~5滴,充入高纯氮气5 min,封口拧紧,将水解管放在(110±2)℃的恒温干燥箱内,同时用多路温度巡检仪连续24 h监测烘箱温度。样品水解22~24 h,取出冷却,观察水解管液面高度,如果液面高度明显降低,表明在水解过程中存在密封不好,需重新称样测试。打开水解管盖,用一级水多次冲洗水解管内壁并将水解液全部转移到100 mL容量瓶定容,过滤并弃去初滤液,准确吸取1.0 mL于10 mL烧杯中75℃水浴蒸干,用2.0 mL 0.02 mol/L稀盐酸溶解,混合均匀后用0.22 μm水相滤膜过滤,得上机溶液,供仪器测定。
1.7 仪器分析条件4.6 mm×60 mm,填料为3 μm磺酸型阳离子树脂分离柱,缓冲液流速0.40 mL/min,反应液流速0.35 mL/min,柱温57℃,测定波长为570 nm和440 nm;每个样品分析时间约32 min,氨基酸自动分析仪以外标法测定氨基酸含量。
1.8 数据处理 连续记录5个月的质控值作为分析样本的原始数据进行统计分析,数据处理用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 25进行分析,质控图用Minitab 17进行绘制。实验数据用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 色谱图 通过L-8900日立氨基酸分析仪分析程序,分离得16种氨基酸混合标准溶液图谱(图1)和质控鱼粉图谱(图2),其基线平稳,峰型窄而尖,峰宽合适,质控鱼粉各氨基酸出峰时间与标准品一致,分离良好。
图1 16种氨基酸标准溶液的分离色谱图
图2 质控鱼粉中16种氨基酸分离色谱图
2.2 质控图的绘制 质量控制过程中每批样品至少一个质控样,按照时间顺序收集结果数据,以测量批次为横坐标,测量值为纵坐标,依据GB/T 17989.2-2020常规控制图绘制控制图——均值-标准差控制图,当测定值超过质控检验模式1所规定控制线±3 s时,则视为失控,本次检验有85批数据,超出控制线有3组,判失控数据有4个(苏氨酸、丝氨酸各1个,蛋氨酸2个),详见表1。
表1 数据统计和处理
2.3 异常数据分析
2.3.1 含羟基脂肪族侧链氨基酸——丝氨酸、苏氨酸数据存在阶段性偏低的情况 通过软件绘制苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)的均值-标准差控制图(图3)看出,从30~39个数据点中,有一个数据点距离中心线超过3倍标准差,属于检验模式1,提示失控状态;在这个数据段,苏氨酸和丝氨酸同时存在数据偏低的情况,提示过程均值或波动性已经偏离中心线。经调看烘箱温度记录(图4),烘箱温度设定110℃,一般波动在±2℃,但在此期间,温度逐渐升高,最高达125℃(烘箱上下限为设定温度±15℃,超出此限值则自动断电),样品中苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)的含量降低原因是干燥箱温度过高,导致样品中含羟基键氨基酸在消解过程中过快损失。发现干燥箱温度异常后马上维修,分析原因是在水解过程中,部分批次样品中出现个别样品水解时水解管密封性不好的问题,盐酸在水解过程中挥发,腐蚀烘箱零部件,特别是风机和探头,造成烘箱的温度失控,这是目前采用电热恒温鼓风干燥箱进行酸水解的弊端之一,也是要24 h监测干燥箱温度的原因。
图3 Minitab软件绘制苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)的均值-标准差控制图
图4 多路巡检仪测得恒温干燥箱温度记录
为了进一步验证水解温度对16种氨基酸的影响程度,设计了样品经不同水解温度(90、100、110、120、130℃)水解24 h的实验,通过检测各氨基酸含量的变化情况来进行验证。
实验结果表明(表2和图5),不同温度对饲料中16种氨基酸的测定结果的影响不同。主要分为2类:第一类是难水解的,例如天冬氨酸(Asp)、谷氨 酸 (Glu)、甘 氨 酸 (Gly)、丙氨 酸 (Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)这几个氨基酸含量随温度的升高逐渐提高,蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸 (Arg)至少要达到110℃才能基本水解完全,达到结果稳定;Darragh等 (1996)和Ozols J(1990))研究表明,在水解阶段各氨基酸会发生不同程度的损失,氨基酸的排序可能影响水解效果。如果支链上是脂肪族氨基酸,那么就会形成位阻,影响水解效率。脂肪族氨基酸之间的化学键,比如异亮氨酸-异亮氨酸、缬氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-缬氨酸之间的肽键最难被打开,110℃水解24 h只能打开50%~70%,随着温度升高,肽键打开越多,含量越高(周梦怡和马小芳,2018);第二类是高温易降解的,例如苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)随着温度的升高含量有显著下降。分析原因,苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)均含有羟基键,极性基团具有亲水性,性质不稳定容易降解,导致损失,容易受高温的影响,需要严格控制并监测氨基酸水解温度。综合来看,酸水解法水解24 h最适水解温度是110℃,此时大多氨基酸含量达到最大。
图5 不同水解温度对氨基酸含量的影响
表2 不同温度条件下氨基酸含量的变化 g/100 g
2.3.2 个别蛋氨酸检测结果偏低 蛋氨酸质控图有2个检测数据超出控制线,2个检测数据超出警告线(图6),提示异常,这里考虑是水解管的密封性不好、充入的氮气不足或无充入氮气导致蛋氨酸结果偏低。充氮气的作用是保护蛋氨酸二硫键在水解过程中不被氧化分解,巯基乙酸也有同样的保护作用。为进一步验证,设计了5组对比实验:(1)充入氮气并添加巯基乙酸;(2)只充入氮气;(3)只添加巯基乙酸;(4)充入氮气并添加巯基乙酸但不密封;(5)为无充入氮气无添加巯基乙酸作对照。实验结果详见表3。
表3 质控鱼粉在充入氮气和添加巯基乙酸等不同条件下对蛋氨酸准确性的影响 g/100 g
图6 Minitab软件绘制蛋氨酸(Met)的均值-标准差控制图
实验结果显示,16种氨基酸检测前处理中添加巯基乙酸并充入氮气主要影响蛋氨酸的含量。实验组1、2、3、4的蛋氨酸含量分别较对照组增高26.5%、25.2%、27.2%、25.2%(P<0.05),说明添加巯基乙酸和充入氮气对蛋氨酸保护较好。另外实验组1、2、3、4的蛋氨酸含量之间并无显著差异(P>0.05),说明有效充入氮气进行保护或添加巯基乙酸,都能达到保护蛋氨酸的作用。
3 讨论
3.1 水解温度对16种氨基酸检测结果的影响本研究发现,由于各氨基酸的结构不同,酸水解24 h其所需的最佳水解温度亦不一样。例如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)属于难水解的氨基酸,水解温度要求110℃以上才能充分水解,而苏氨酸、丝氨酸对温度敏感,最佳水解温度为100℃,特别是超过110℃会导致含量明显降低,例如水解温度从110℃升到130℃时,苏氨酸含量从2.75 g/100 g下降到2.33 g/100 g(下降了15.3%),丝氨酸含量从2.38 g/100 g下降到1.57 g/100 g(下降34.0%)。综合来看,同时检测16种氨基酸组分的最佳水解温度为110℃。因此在氨基酸检测前处理过程中,要严格控制水解温度在(110±2)℃,必要时进行在线温度监控,以保证各氨基酸组分检测结果的准确性。
3.2 充氮气和添加巯基乙酸对蛋氨酸检测结果的影响 本研究通过五组对比实验,发现充氮气或添加巯基乙酸均能很好的保护蛋氨酸在水解过程中不被破坏。通过充氮气或添加巯基乙酸的方式与对照组相比,最高提高蛋氨酸含量达27.2%。说明在氨基酸检测前处理过程中,采用充氮气或添加巯基乙酸的方式对蛋氨酸进行保护是非常必要的,同时充氮气和添加巯基乙酸两种方法对结果的影响无显著性差异(P>0.05),因此,可以根据实验室情况进行选择。
4 结论
本文通过对质控样品的质控图分析发现,丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸受到烘箱水解温度波动或在水解过程中被破坏等因素的影响,导致结果出现偏差。确定了同时检测16种氨基酸的最佳水解温度为110℃,并且必须严格控制,必要时要进行在线温度监控,同时可以通过充氮气或添加巯基乙酸的方式保护蛋氨酸在水解过程中不被破坏,以此确保氨基酸检测结果准确性。