不同抗菌检测方法对四种药物抗菌效果评判的影响

李福元 ，陈光玉 ，王秀敏 ，王海良 ，温天乙

（1.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102609；2.北京市中兽药工程技术研究中心，北京 102609；3.北京市兽药饲料监测中心，北京 102609）

抗菌药物的抗菌效果检测结果是临床应用的重要依据，常用的检测方法有扩散法、稀释法、菌落计数法、MTT比色法以及营养物质消耗法等[1-2]。兽医临床中常用的是扩散法和稀释法。其中，扩散法包括药敏片法、杯碟法等[3]；稀释法包括肉汤稀释法、微量稀释法等。对同一种药物使用不同检测方法，其评判结果也会出现差异。例如，采用杯碟法所产生的抑菌圈的边缘药物浓度无法得知，所以无法将抗菌效果和动物体内血药浓度联系起来，也无法准确给出临床药物浓度标准。

1 材料与方法

1.1 试验材料

沙门菌，来自中国兽医药品监察所；氨苄青霉素钠，来自华北制药集团制剂有限公司；阿莫西林钠，来自上海麦克林生化科技有限公司；盐酸土霉素，来自上海麦克林生化科技有限公司；香连溶液，来自爱迪森（北京）生物科技有限公司；普通营养肉汤培养基、营养琼脂培养基，来自北京中海生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

双人单面净化工作台（SWCJ-2FD），恒温培养箱（DHP-9272），电子天平（BX820S），立式高压蒸汽灭菌器（LDZX-30KBS），移液枪。

1.3 试验方法

1.3.1 药物配制。取氨苄青霉素钠、阿莫西林钠、盐酸土霉素各0.1 g，分别加入无菌生理盐水定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL的溶液，待用。取12.5 g香连溶液原液，加入无菌生理盐水定容到100 mL，配制成125 mg/mL的溶液，待用。

1.3.2 用稀释法测定最小抑菌浓度。取灭菌具塞试管10支，编号后排列于试管架上。于每支试管中加入5 mL灭菌生理盐水。于第1支试管中加入5 mL供试药品原液，混合均匀，取5 mL加入第2支试管中，振摇混合均匀后，取5 mL加入第3个试管中，依此类推，直至稀释到第8个试管。将第8支试管中的液体混合均匀后，取出5 mL弃去。在稀释好的药液中分别加入5 mL普通营养肉汤培养基（2×）。按照此稀释方法得到的氨苄青霉素钠、阿莫西林钠、盐酸土霉素的浓度分别 为 250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.91 和1.95 μg/mL； 香连溶液的浓度分别为 31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 和 0.24 mg/mL。 在以上各组中加入20 μL沙门菌菌液。第9支试管为阳性组，加入5 mL灭菌生理盐水、5 mL普通营养肉汤培养基（2×）和 20 μL供试菌悬液。第 10支试管为阴性组，加入5 mL灭菌生理盐水、5 mL普通营养肉汤培养基（2×），不加菌液。将各试管置于37℃培养箱中培养18～24 h，以阳性组出现浑浊而阴性对照组无菌生长时为培养结束时间点。观察各试验组，以试管澄清的最低稀释浓度为该样品的最小抑菌浓度[4-5]。

1.3.3 用杯碟法测定抗菌效果。按说明书配制营养琼脂培养基，121℃高压灭菌20 min，待温度降至50～60℃时，倾入无菌平皿，使琼脂厚度达4～5 mm，凝固后待用[6]。

取沙门菌在营养琼脂培养基平板上进行三区划线，37℃培养24 h。挑取单个菌落，接种于普通肉汤培养基，37℃培养24 h。用营养肉汤进行活化菌液的10倍递增稀释。取各稀释度菌液100 μL涂布于相应的琼脂平板上，各稀释浓度做3个重复。37℃培养18～24 h，观察菌落生长状况，以确定各菌的最佳涂布浓度。

无菌操作取合适浓度的供试菌液100 μL滴于培养基表面，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面。将灭菌的牛津杯放置在每个平皿培养基上，注入同体积药液，静置30 min后37℃培养18～24 h，用游标卡尺测量药物的抑菌环直径，同时做平行对照，取平均值[7]。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度检测

由表1可知，氨苄青霉素钠对沙门菌的MIC为3.91 μg/mL，阿莫西林钠对沙门菌的MIC也为3.91 μg/mL，盐酸土霉素对沙门菌的MIC为7.81 μg/mL。由表2可知，香连溶液对沙门菌的MIC为1.95 mg/mL。

表1 最小抑菌浓度测定结果（μg/mL）

表2 最小抑菌浓度测定结果（mg/mL）

2.2 杯碟法检测

由表3可知，氨苄青霉素钠对沙门菌的MIC处于 3.91 μg/mL 时抑菌圈直径为（17.0±0.9）mm，阿莫西林钠对沙门菌的MIC处于3.91 μg/mL时抑菌圈直径为（21.0±1.1)mm，盐酸土霉素对沙门菌的MIC处于 7.81 μg/mL时抑菌圈直径为(18.4±0.8)mm。由表4可知，香连溶液对沙门菌的MIC处于1.95 mg/mL时抑菌圈直径为(6.5±0.2)mm。

表3 3种抗生素各浓度抑菌圈直径（mm）

表4 香连溶液各浓度抑菌圈直径（mm）

3 讨论

对病原菌药物敏感性的检测在指导临床用药方面发挥着重要作用[8-9]。抑菌圈的大小对评价药物的抗菌效果具有直接意义。但本试验表明，出现抑菌圈的药物浓度并不一定大于药物的最小抑菌浓度。氨苄青霉素钠对沙门菌的MIC为3.91 μg/mL时，抑菌圈为（17.0±0.9）mm，抑菌圈小于(17.0±0.9)mm 的药物浓度，使用倍比稀释法检测不到完全抑菌效果；阿莫西林钠对沙门菌的MIC为3.91 μg/mL，此浓度下的抑菌圈直径为(21.0±1.1)mm，抑菌圈小于(21.0±1.1)mm 的药物浓度，使用倍比稀释法检测不到完全抑菌效果；盐酸土霉素对沙门菌的MIC为7.81 μg/mL，此浓度下抑菌圈直径为(18.4±0.8)mm，抑菌圈小于(18.4±0.8)mm的药物浓度，使用倍比稀释法检测不到完全抑菌效果；香连溶液对沙门菌的MIC为1.95 mg/mL，此浓度下的抑菌圈直径为(6.5±0.2)mm，抑菌圈小于(6.5±0.2)mm的药物浓度，使用倍比稀释法检测不到完全抑菌效果。通过以上结果得出，药液出现抑菌圈的浓度并不一定大于最小抑菌浓度，当抑菌圈小于最小抑菌浓度所对应的抑菌直径时，有可能达不到完全抑菌效果。所以临床评价抗菌药物的效果时，使用杯碟法等方法得出的评价结果并不一定是准确的。推测其原因可能是在检测时，药液处在37℃的环境中，在扩散过程有溶剂蒸发，由此造成药液的局部浓度升高从而出现抑菌圈。