基于OPLS-DA结合熵权TOPSIS的不同产地益智仁综合质量评价△

崔婷，李焐仪，文珊，胡懿，彭杰宝，程钰洁，徐杰

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

益智为姜科植物益智Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果实，主产于海南、广东、广西等地，为“四大南药”之一，临床常以除去杂质及外壳后的饮片益智仁入药，其性温，味辛，归脾、肾经，有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾的功效，主要用于肾虚遗尿、小便频数、遗精白浊、脾寒泄泻、腹中冷痛、口多唾涎等症[1]。现代药理研究表明，益智仁有保护神经、镇静抗炎、抗癌等作用[2]。中药物质成分组成复杂多样，以单一指标进行质量评价存在一定局限性。益智仁主要化学成分有挥发油类、黄酮类、甾醇类、萜类及二苯基庚烷类等[3-6]，而《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（一部）益智仁含量测定项下仅规定了挥发油的限度，显然不利于益智仁的质量控制。中药指纹图谱是中药整体性化学成分的表征，可以较为全面地反映中药化学成分信息。熵权逼近理想解排序法（TOPSIS）可将多指标转化为一个综合指标，降低分析过程中不同类型指标的干扰，也可避免人为赋权的主观性，使分析结果更为客观合理[7-8]。结合指纹图谱与熵权TOPSIS对不同产地益智仁的质量进行综合评价，结果更科学。同时，挥发油、浸出物、灰分、二氧化硫残留量等也是影响益智仁质量的重要因素。因此，本研究建立益智仁超高效液相色谱法（UPLC）指纹图谱，并结合挥发油、浸出物、灰分、二氧化硫残留量等指标，采用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）和熵权TOPSIS 对不同产地益智仁的整体质量进行综合评价，以期为益智仁质量控制及产地适应性研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

H-CLASS 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；ME204E 型万分之一天平、XP26 型百万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）；实验室Milli-Q超纯水系统（默克股份有限公司）；111B 型二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 试药

对照品原儿茶酸（中国食品药品检定研究院，批号：110809-201205，纯度：99.9%）；圆柚酮对照品（深圳市丽景生物科技有限公司，批号：6-JTN-173-1，纯度：100%）；色谱级甲醇、乙腈（默克股份有限公司）；色谱级磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

15 批益智仁均为自购饮片，经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为姜科植物益智Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果实除去杂质及外壳后的饮片，样品来源见表1。

表1 15批益智仁来源信息

2 方法与结果

2.1 UPLC指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，8%～16%A；8～18 min，16%A；18～32 min，16%～25%A；32～35 min，25%～35%A；35～44 min，35%A；44～60 min，35%～73%A；60～62 min，73%～8%A；62～65 min，8%A）；流速：0.35 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：2 μL；柱温：30 ℃。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶酸、圆柚酮对照品适量，加甲醇制成原儿茶酸、圆柚酮质量浓度分别为101.78、159.44 μg·mL-1的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取益智仁饮片粉末（过四号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，称定质量，超声处理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 精密度试验 取2.1.3 项下供试品溶液（编号：HNS-S1），按2.1.1项下色谱条件连续进样6次，以13 号圆柚酮色谱峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间RSD＜0.15%，相对峰面积RSD＜0.43%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取2.1.3 项下供试品溶液（编号：HNS-S1），按2.1.1 项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，以13 号圆柚酮色谱峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间RSD＜0.12%，相对峰面积RSD＜0.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 分别精密称取益智仁饮片粉末样品（编号：HNS-S1）6 份，按2.1.3 项下方法制备供试品溶液，并按2.1.1 项下色谱条件进样，以13 号圆柚酮色谱峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间RSD＜0.28%，相对峰面积RSD＜0.64%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 指纹图谱的建立及色谱峰指认 取15 批益智仁饮片样品，按2.1.3 项下方法制备供试品溶液，并按2.1.1 项下色谱条件进行测定，记录各特征峰峰面积，并进行量化处理（峰面积/取样量/60 000），结果见表2。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）对采集的色谱图进行处理，以HNS-S1样品的色谱图为参照图谱，设置时间窗宽度为0.1 min，通过多点校正、全谱峰匹配生成共有指纹图谱，同时采用中位数法生成对照指纹图谱R，并建立益智仁饮片UPLC 指纹图谱（图1）。通过与混合对照品比对，指认出2个成分，分别为1号色谱峰（原儿茶酸）、13 号色谱峰（圆柚酮），对照图谱见图2。

图1 15批不同产地益智仁饮片共有峰特征图谱

图2 益智仁饮片对照指纹图谱及混合对照品UPLC图

表2 15批益智仁饮片量化后各特征峰相对峰面积

2.1.8 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）分析软件，以对照图谱R为参照，进行整体相似度评价。结果显示，益智仁不同批次间指纹图谱基本相似，与对照图谱一致性较好，15批益智仁饮片相似度依次为0.999、1.000、0.998、1.000、0.999、0.999、1.000、0.992、0.986、0.996、0.996、0.997、0.997、0.996、0.996，相似度均大于0.980，符合指纹图谱的研究要求。

2.2 挥发油量的测定

按《中国药典》2020 年版（通则2204 挥发油测定法）甲法[9]，对15 批益智仁中挥发油量进行测定，结果见表3。结果显示，15 批益智仁挥发油质量分数为1.1%～1.6%，均大于1.0%，符合《中国药典》2020年版益智仁项下挥发油的限度要求。

2.3 浸出物测定

按《中国药典》 2020 年版（通则2201 浸出物测定法）热浸法[9]，对15 批益智仁醇溶性浸出物、水溶性浸出物进行测定，结果见表3。结果显示，15 批益智仁醇溶性浸出物质量分数为4.19%～8.07%，均值为6.50%；水溶性浸出物质量分数为15.55%～18.17%，均值为17.01%。

表3 15批益智仁各项指标检测结果

2.4 二氧化硫残留量测定

按《中国药典》2020 年版（通则2331 二氧化硫残留量测定法）第二法[9]，对15 批益智仁二氧化硫残留量进行测定，结果见表3。结果显示，15 批益智仁二氧化硫残留量为0～54 mg·kg-1，均小于150 mg·kg-1，符合《中国药典》2020年版通则限度要求。

2.5 灰分测定

2.5.1 总灰分测定 按《中国药典》2020 年版（通则2302灰分测定法）总灰分测定法[9]，对15批益智仁总灰分进行测定，结果见表3。结果显示，15批益智仁总灰分质量分数为4.2%～8.5%，均小于8.5%，符合《中国药典》2020年版益智项下总灰分的限度要求。

2.5.2 酸不溶性灰分测定 按《中国药典》2020年版（通则2302 灰分测定法）酸不溶性灰分测定法[9]，对15 批益智仁酸不溶性灰分进行测定，结果见表3。结果显示，15 批益智仁酸不溶性灰分质量分数为0.3%～1.5%，均小于1.5%，符合《中国药典》2020年版益智项下酸不溶性灰分的限度要求。

2.6 OPLS-DA

以15 批益智仁饮片挥发油量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫残留量及15 个特征峰峰面积量化值为变量，采用SIMCA 14.1 软件进行OPLS-DA，得分见图3，不同产地益智仁饮片呈现一定分类聚集现象。OPLS-DA模型中变量重要性投影（VIP）值见图4，VIP 值越大，即变量离X轴越远，表明该指标对区分不同产地益智仁的贡献越大，可能是区分不同产地益智仁的差异性成分。VIP 值＞1.0 的指标分别为峰13（原柚酮，2.670）、二氧化硫残留量（1.808）、峰4（1.513）、峰14（1.485）、峰11（1.258），说明以上指标对不同产地益智仁的分类影响显著。

图3 15批益智仁饮片OPLS-DA得分

图4 15批益智仁饮片各指标VIP分析（±s, n=15）

2.7 熵权TOPSIS分析

2.7.1 归一化法处理 由于益智仁各指标成分存在量纲不一致的问题，因此需要根据公式（1）、（2）对数据进行同向归一化处理，建立标准化决策矩阵[7-8]。峰1～15（峰1为原儿茶酸）、挥发油量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物为越大越优型指标，采用公式（1）计算，总灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫残留量为越小越优型指标；采用公式（2）计算，各指标归一化处理结果见表4。

表4 益智仁饮片各指标同向归一化处理结果

式中Rij代表不同指标类型，在公式（1）中为越大越优型指标，在公式（2）中为越小越优型指标，Xij代表样本值i=（1，2，……，m）；指标值j=（1，2，……，n）所形成的多目标决策矩阵为Xij。

2.7.2 各指标成分权重的确定 熵权法是基于评价指标的信息熵大小与差异离散程度，指标数据离散程度越高熵值就越小，说明该指标提供的有效信息量就越大，对综合评价的影响就越大。熵值法计算指标权重，可以决定各指标在样品评价过程中的重要性，客观地评价各个指标，排除主观因素的影响[7-8]，按公式（3）、（4）计算各指标权重（wj），分别 为0.060、0.124、0.061、0.075、0.037、0.049、0.051、0.046、0.038、0.022、0.054、0.042、0.061、0.074、0.042、0.028、0.018、0.014、0.056、0.036、0.012。

式中Ej指第j项指标的熵值，wj指第j项指标的权重。

2.7.3 最优与最劣方案的确定 将归一化后数据与各指标的权重进行相乘，得加权决策矩阵Z[7-8]。根据加权矩阵结果得到最优方案Z+=max（Z1，Z2，......Zm）；最劣方案Z-=min（Z1，Z2，......Zm）。

2.7.4 贴近度的计算及评价 根据最优与最劣方案，按公式（5）计算15 批益智仁样品与Z+和Z-的距离D+和D-，并根据距离D+和D-，按公式（6）计算评价对象与Z+的贴近度Ci[7-8]，并根据Ci的大小对评价对象进行排名。Ci在［0，1］内，越大表示该评价对象越好，反之，越差，见表5。

2.7.5 熵权TOPSIS 分析结果 本研究中的指标，以各特征峰峰面积、挥发油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量为高优型指标，总灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫残留量为低优型指标，由表5 可知，海南省琼中县（HNS-S1～S3）、海南省屯昌县（HNS-S4～S6）、海南省万宁市（HNS-S7～S9）、广东省阳春市（GDS-S10～S12）、广东省高州市（GDSS13～S15）平 均Ci分别为0.520、0.378、0.577、0.206、0.207，表明海南产益智仁综合质量整体优于广东省，且以海南省万宁市质量最优，可作为优良种质资源进一步研究与开发。

表5 15批益智仁饮片质量综合评价结果

3 讨论

本研究分别比较了不同柱温（25、30、35 ℃）及流速（0.25、0.30、0.35 mL·min-1）条件下的指纹图谱，结果表明柱温为30 ℃，流速为0.35 mL·min-1时，样品分离度较好，峰形较对称，能够满足分析要求。同时以指纹图谱峰峰形、分离度及共有峰总峰面积为评价指标，分别考察了不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇）及提取时间（15、30、45 min），结果表明，以70%甲醇为溶剂提取30 min时得到的峰形及分离度较好，共有峰总峰面积较大。

本研究建立了益智仁UPLC指纹图谱，标定了15个共有峰，并对15批益智仁饮片的15个共有峰峰面积进行了测定，同时测定了15批饮片的挥发油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量、二氧化硫残留量、总灰分和酸不溶性灰分。结果显示，不同产地益智仁指纹图谱共有峰总峰面积均值排序为海南省琼中县＞海南省万宁市＞海南省屯昌县＞广东省阳春市＞广东省高州市；挥发油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量、总灰分、酸不溶性灰分整体差异不大，海南省琼中县产益智仁二氧化硫残留量明显低于其他产区。

本研究采用OPLS-DA 分析各产地益智仁的质量差异，筛选影响益智仁质量的主要指标，峰13、峰4、峰14、峰11 的峰面积及二氧化硫残留量可作为区分不同产地益智仁的主要指标；同时参照熵权TOPSIS 在中药质量分析中的应用，建立益智仁饮片整体质量评价模型，对15 批益智仁进行质量评价。结果显示，5 个不同产地益智仁样品的Ci排序为海南省万宁市＞海南省琼中县＞海南省屯昌县＞广东省高州市＞广东省阳春市，与各指标评价结果基本一致。

本研究采用熵权TOPSIS对各指标进行客观权重赋值，排除了主观赋值对实验结果的影响，提高分析结果的准确性与科学性，实现对益智仁整体质量的控制。该方法相对于传统中药材质量评价模式，结果更为科学、客观，可应用于对不同产地益智药材及其他中药的质量评价及种质筛选。