核因子E2相关因子1诸多亚型的产生机制及其在疾病中的作用

贾 蔓， 吕金晶， 向远彩, 2)*

(1)西南医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室， 四川 泸州 646000；2)第三军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室， 重庆 400038)

核因子E2相关因子1 (nuclear factor-erythroid 2 related factor 1，Nrf1/Nfe2l1)是CNC-bZIP (cap'n'collar basic leucine zipper)家族的成员之一，广泛表达于多种组织细胞。其中，以心血管、肾、卵巢、骨骼肌中居多[1]。该转录因子能直接调控抗氧化相关蛋白质、炎症反应相关酶等基因的表达，使细胞在应对内外环境刺激时发挥解毒、抗氧化作用以及细胞保护反应以维持细胞稳态[2]。众多研究揭示，Nrf1功能异常会导致糖尿病、非酒精性脂肪肝、肝癌和肌萎缩等多种疾病[3, 4]。值得一提的是，通过靶向Nrf1的不同区域而构建的全基因敲除小鼠，在胚胎致死时间上存在明显的差异[5, 6]，Ren等推测，这可能与在不同位置缺失后Nrf1产生不同的小分子亚型有关[7]。进一步分析Nrf1及其长亚型TCF11在正常肝细胞与肝癌细胞中的比例时，发现正常肝细胞中两者所占比例相当，而肝癌细胞中却以Nrf1为主[8]。近期，Wang等通过构建Nrf1不同亚型的稳定细胞株也证实，各亚型可以对细胞生物学功能进行差异化调控[9]。由此可见，理清Nrf1各亚型的特征与功能对全面理解Nrf1的作用至关重要。因此，本文对Nrf1的发现历程和各亚型的产生机制，及其在疾病中的作用进行简略综述。需要说明的是，Nrf1在发现的过程中曾出现多个名称缩写，例如TCF11、LCR-F1、Nfe2l1、HBZ17 (详见Pubmed gene database)。其中，Nrf1与核呼吸因子(nuclear respiratory factor 1，NRF1)缩写相同，已使部分学者混淆[10-12]。目前，核因子E2相关因子1的官方缩写为Nfe2l1，为与当前其亚型的命名一致，本文统一用Nrf1缩写表示。

1 核因子E2相关因子1的发现历程

早在1993年，Chan等在细胞株K562的cDNA文库中筛选出1个与NF-E2 (nuclear factor-erythroid 2)转录因子高度同源的蛋白质，将其命名为NF-E2-related factor 1 (又称NF-E2 like 1，缩写为Nrf1或Nfe2l1)。后来，被先后更名为Nrf1a[13]、Nrf1α[14]。此外，Caterina等[15]和Luna等[16]分别在cDNA文库中筛选出2个bZIP蛋白质——TCF11、LCR-F1 (后被更名为Nrf1β[14])。Southern结果显示，LCR-F1与Nrf1来源于同一基因[16]。Luna等进一步研究三者的关系时发现，TCF11、LCR-F1、Nrf1为同一基因的3个不同大小的蛋白质亚型[16]。自此，关于核因子E2相关因子1的研究逐渐拉开序幕。

2 核因子E2相关因子1亚型产生的机制

2.1 选择性剪接加工

序列分析发现，Nrf1长亚型 (TCF11) 的9个外显子中存在可选择性剪接[17]。为规范描述，Zhang等[4]将这些外显子依次重新命名为1a/1b、2a/2b、3、4、5、6a/6b (Fig. 1A)，并根据其氨基酸序列特征将其分为NTD (N-termianl domain)、AD1 (acidic domain 1)、NST (Asn/Ser/Thr-rich)、AD2、SR (serine-repeat)、Neh6L (Nrf2-ECH homology 6 like)、CNC、bZIP、CTD (C-terminal domain) 9个结构域(Fig. 1B)。

Fig.1 The detailed information of Nrf1 and its major isoforms (A) The transcriptional information of Nrf1, which was obtained from Ensembl genome browser (https://asia.ensembl.org/index.html). (B) The information of distinct domains in different isoforms of Nrf1. NHB1: N-terminal homology box 1 (11-30 aa); NTD: N-terminal domain (1-124 aa); NHB2: N-terminal homology box 2 (81-106 aa); AD1: Acidic domain 1 (125-295 aa); NST: Asn/Ser/Thr-rich (296-403 aa); AD2: Acidic domain 2 (404-453 aa); SR: Serine-repeat (454-488 aa); NehL: Neh6-like (489-580 aa); CNC: Cap’n’collar (581-624 aa); bZIP: Basic-regiozipper (625-686 aa); CTD: C-terminal domain (687-742 aa); The indicated amino acid positions of distinct domains are identified in the sequence of Nrf1α[4]

由于具有可选择性的特性，因而TCF11可通过选择性剪切产生多种亚型。例如，TCF11转录本中编码30个氨基酸的外显子4剪切后形成Nrf1α亚型[8]。另外，Novotny等在小鼠肥大细胞中克隆发现了变体D、变体767和变体10等多种剪接体。其中，具有分泌特性的变体D是Nrf1α的羧基端72个残基被另外80个残基所取代而来[18, 19]，变体767由Nrf1α的氨基端181个残基被12个残基替代而来，而变体10则是在Nrf1α的454～580 aa区域内缺失137个残基而来。这3个变体后续依次被更名为Nrf1D、Nrf1ΔN、Nrf1ΔS。此外，Luna等还在5′-、3′-端非编码区及编码区内发现，因删除突变而产生的具有769 aa、742 aa和730 aa的亚型[16]。尽管目前已发现多种因转录水平剪接产生的变体，但其具体的机制仍不清楚，有待深入探索。

2.2 内部选择性翻译起始

除了选择性剪接形成多个转录本外，在蛋白质翻译过程中也可以选择性从转录本内部不同起始位点进行翻译，形成分子量大小不同的亚型。例如，通过定点突变发现，Nrf1α可从M289/292/294/2974个位置翻译成弱活性Nrf1β亚型，从M417/424、M523/548处翻译分别形成具有抑制作用的Nrf1γ、Nrf1δ亚型[8, 14, 20](Fig. 1B)。这种由内部翻译起始的不同导致了不同作用亚型的产生的特征为Nrf1参与多种生理过程并进行差异化的调控奠定基础。

2.3 翻译后剪切加工

已有研究表明，Nrf1除了可以从内部翻译起始产生不同的亚型外，还能通过翻译后加工剪切产生不同的亚型。例如，定点突变Nrf1β、Nrf1γ、Nrf1δ的内部翻译起始位点，过表达Nrf1时三者并未完全消失，同时还出现了其他诸如46 kD的小分子量条带[8, 21]。类似的结果在其他课题组也有发现。例如，Chepelev等研究发现，在低氧条件下培养COS7与WFF2002细胞6 h后，用特异性识别Nrf1 191～475 aa区域的抗体进行免疫印迹检测，发现了分子量约为23 kD的蛋白质。根据抗体所识别的区域推测，该条带可能来自于翻译后蛋白酶加工[22]。除此之外，Zhang等[8]发现，低剂量的蛋白酶体/钙蛋白酶抑制剂，可增加Nrf1活化亚型(例如85 kD条带)的丰度以增加其转录活性。然而，在高剂量时则通过增加Nrf1γ、Nrf1δ亚型负调控Nrf1的转录活性。

值得一提的是，自Nrf1被发现位于内质网膜上以来，关于其翻译后剪切加工的机制一直饱受争议，主要有3种剪切加工模型，具体如下：

第一，Zhang等提出的“跨膜动态加工”模型认为[8, 14, 23](Fig. 2)：Nrf1锚定于内质网膜上，在其氨基端跨膜结构TM1 (transmembrane 1)与内部潜在的跨膜肽段共同作用下，通过自身的电荷状态调整肽段在膜上的朝向，从而使Nrf1在内质网膜上进行动态转换。当Nrf1以氨基端朝向内质网的胞浆一侧的形式锚定于内质网膜上时，其转录激活区域TAD被转位进入内质网腔，继而经过糖基化修饰(O-连接、N-连接)形成无活性的糖蛋白质；随后，由p97提供动力，TAD的部分区域逆转位进入胞浆，并在酶的作用下去糖基化形成脱糖形式的蛋白质，随即经胞浆内26 S蛋白酶体、钙蛋白酶(calpains)等水解加工，将其从内质网膜释放并产生85 kD活化亚型；该活化亚型经核孔进入核内启动下游基因表达。其中，26 S各亚基(PMSs)是Nrf1的重要靶基因，当26 S功能被部分抑制后(即低剂量抑制剂)，其可通过阻止Nrf1的降解得以激活表达。此外，活化前的脱糖形式蛋白质还可能通过脂膜转运而直接进入核内调控下游基因表达。

Fig.2 Post-translation processing models of Nrf1 TM1: Transmembrane 1; TAD: Transactivation domain; bZIP: basic leucine-zipper; DDI1/2: DNA damage induction 1 homologue 1/2; sMafs: small Maf; GTM: general transcriptional machineries; ARE: antioxidant response element; PSMs: proteasome subunit gene[8]

第二，Radhakrishnan等提出的“位点特异性剪切加工”模型指出[24]：Nrf1的氨基端锚定在内质网膜上时，其氨基端朝向内质网的胞浆侧，羧基端位于内质网腔；在生理条件下，Nrf1的羧基端主体在p97作用下“翻转”至细胞浆一侧，随后在26 S的作用下降解，以维持较低的本底水平；当26 S功能被抑制时，“翻转”至细胞浆中的Nrf1降解受阻。随后，在蛋白酶的作用下，在103与104位氨基酸间进行特异性剪切，从而将其从内质网膜上释放，并由核孔入核，调控下游靶基因如PSMs的表达。

第三，Sha与Goldberg[25]提出的“泛素依赖性剪切加工”模型认为：在正常生理状态下，锚定在内质网膜上的Nrf1借助p97提供的动力，将内质网腔的羧基端部分“翻转”至细胞浆中。随后，经泛素化修饰被26 S降解；然而，在用26 S抑制剂处理时，泛素化的Nrf1可被仅具有部分活性的26 S (即低剂量抑制剂时)剪切加工，使Nrf1从内质网上释放，并转移至细胞核内调控下游靶基因。例如，PSMs、p97等的表达；而在高剂量时，26 S功能因被完全抑制导致其无法对Nrf1进行加工活化。

随着研究的深入，Nrf1剪切加工酶DDI1/2 (DNA-damage inducible 1 homolog 1/2)的发现，为辨析这3种模型带来转机[26, 27]。在此基础上，Xiang等[28, 29]通过突变Nrf1 101～105位氨基酸与氨基端泛素化位点，以及干预DDI1/2、p97等方法揭示：泛素化不是Nrf1剪切加工的必要条件，而且Nrf1加工位置并不具有位点特异性，仅与氨基端是否形成正确的拓扑结构有关，即Nrf1在内质网上动态转换的过程中，一旦形成适合剪切加工的空间结构，其均能通过近膜水解加工模式(regulated juxtamembrane proteolysis)完成剪切，并从内质网上释放(Fig. 2)。

综上所述，Nrf1可通过mRNA剪切、选择性翻译起始与翻译后剪切加工等方式产生具不同功能的亚型。

3 核因子E2相关因子1不同亚型的生物学功能

从目前的研究进展来看，Nrf1可以直接启动HO1、NQO1、HK1、ATF6、CD36等基因的表达，进而调控氧化还原平衡、内质网应激和炎症等过程(详见文献[3])。Nrf1主要亚型的结构域信息显示，它们均包含CNC-bZIP 结构域(Fig. 1B)。该结构域可与抗氧化或亲电反应元件(ARE或EpRE)结合启动下游相关基因的表达，因而其各个亚型在发挥生物学功能方面有许多相似之处。例如，Zhang等通过ARE驱动的荧光报告基因实验分析Nrf1的转录活性时发现，Nrf1β因缺乏部分转录激活结构域AD1而表现出较弱的转录活性[21]。尽管如此，不同亚型之间的调控仍存在一些差异，例如在COS-1细胞中过表达Nrf1γ、Nrf1δ则抑制ARE驱动的荧光报告基因的活性，而且阻断Nrf1δ可增强Nrf1α、Nrf1β的活性。根据其结构域的组成推测，缺失转录活化结构域的Nrf1γ、Nrf1δ可能通过竞争性结合于靶基因的ARE序列从而发挥抑制作用[21]。为了更好地比较Nrf1主要亚型在靶基因调控上的差异，Wang等[9]构建四环素诱导表达的Nrf1α、Nrf1β和Nrf1γ细胞系，并对每个亚型调控的靶基因进行高通量测序分析，发现3种亚型参与不同的生物学过程。其中，Nrf1α调控的差异性基因主要在转录调控、RNA代谢、细胞周期、大分子代谢和细胞应激反应等方面高度富集；Nrf1β亚型调控的差异性基因主要参与细胞内信号级联、磷酸化和生物合成等过程；Nrf1γ亚型则在细胞增殖调控、损伤反应、蛋白质代谢、血管发育等过程发挥基因调控功能。

虽然Nrf1的不同亚型在细胞层面上的调控具有较大的差异，但这种差异能否对生物的整体功能产生影响仍然未知。从仅有的几组动物实验可以推测，这些亚型可能参与胚胎的发育，例如Chen等[6]构建bZIP-CTD缺失Nrf1敲除小鼠时发现，敲基因鼠在妊娠中后期(12.5 dpc)出现死亡。Farmer等[5]构建LCR-F1/Nrf1β全基因敲除小鼠，在胚胎发育的早期阶段(6.5-7.5 dpc)就出现了死亡。值得一提的是，Yuan等[19]在血浆中发现了Nrf1D，并提示Nrf1D具有分泌功能。

尽管目前关于Nrf1不同亚型的生物学功能研究非常有限，但现阶段的研究所揭示的功能表明，Nrf1各亚型在转录活性、转录调控的靶基因以及胚胎发育等方面发挥差异化调控作用，这种功能上的多样性恰恰提示着Nrf1在机体内的重要性，亟待进一步研究。

4 核因子E2相关因子1亚型产生过程异常在疾病中的作用

已有的研究揭示，Nrf1可通过调节线粒体稳态、蛋白质稳态、氧化还原平衡等方面影响脂肪细胞肥大、炎症和胰岛素抵抗等过程[30-33]，并且也对心血管的缺血损伤具有保护作用[34]。其功能缺失引发非酒精性脂肪肝、肝癌、神经退行性疾病和糖尿病等多种疾病[3, 4]。而且，近几年在肝癌细胞、胰岛素瘤中的研究提示，Nrf1具有抑癌基因的作用[35, 36]。尽管Nrf1在系统发育中的整体功能已经阐明，但其因翻译后修饰加工异常引起的疾病在近几年才逐渐被揭示，其具体作用如下所述：

4.1 在肿瘤中的作用

在大部分的肿瘤生长过程中，泛素-蛋白酶体途径通常处于高度活化状态，以维持胞内蛋白质快速稳定的增加。上述Nrf1剪切加工模型表明，26 S亚基是Nrf1的重要靶基因，因此，在抑制肿瘤细胞26 S活性的过程中容易活化Nrf1，增加26 S亚基的表达，缓解26 S抑制时带来的蛋白质应激，即“反弹”效应[37-40]。这也是在临床上用蛋白酶体抑制剂类药物治疗肿瘤产生强耐药性的重要原因之一。由于Nrf1加工活化时涉及去糖基化、转位、泛素化、蛋白酶与蛋白酶体剪切加工等过程，理论上阻断其中任一过程即可破坏Nrf1介导的蛋白酶体“反弹”效应，从而增强蛋白酶体抑制剂的肿瘤杀伤作用。这一点在诸多研究中得到证实(见Table 1)。例如，Le Moigne等[41]用p97抑制剂CB-5083和蛋白酶体抑制剂bortezomib同时作用于多发性骨髓瘤细胞后发现，CB-5083可阻止bortezomib对Nrf1的活化加工与核转位[41]。体内研究也证实，CB-5083与bortezomib的联合处理明显抑制肿瘤进展。又如，用基因敲除技术或抑制剂靶向脱糖基化酶(N-Glycanase 1，NGLY1)、蛋白酶(DDI2)以影响Nrf1的去糖基化及翻译后加工可增强bortezomib等对多发性骨髓瘤、结直肠癌细胞的毒性[26, 42, 43]。另外，近期的研究结果显示，可通过上游分子CPEB3调控Nrf1的转录，进而调节结直肠癌细胞的蛋白酶体活性，并与临床上的不良预后相关[44]。

Table 1 The antitumor drugs target the transcription and post-translational processing of Nrf1

除了通过破坏蛋白酶体“反弹”效应来增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性以外，还可以通过Nrf1的抗氧化作用来增加药物的杀伤作用。例如，用二甲双胍(Metformin)抑制Nrf1的转录，并促进转录后降解以增强ROS (reactive oxygen species)的产生，从而抑制人肝癌细胞的生长[47]。此外，已有研究表明，通过调控miRNA影响Nrf1的表达也是肿瘤治疗的可行方法之一，例如Chang等[48]发现，Metapristone可通过降低miR-492及其下游靶基因(Klf5和Nrf1)的表达，抑制子宫内膜癌细胞生长。

综上所述，在肿瘤细胞中通过靶向Nrf1转录、去糖基化和转位等剪切加工过程，阻止Nrf1的激活，破坏蛋白酶体“反弹”效应等方法提高抗肿瘤药物的肿瘤杀伤作用具有很强的可行性。

4.2 在其他疾病中的作用

4.2.1 胆固醇代谢相关疾病 胆固醇增多是糖尿病、脂肪肝、神经退行性病变和动脉粥样硬化的重要致病因素。Widenmaier等[49]在研究胆固醇稳态的过程中揭示，当胆固醇含量过高时，内质网中胆固醇可与Nrf1的胆固醇结合位点结合，抑制其剪切加工，从而影响Nrf1的定位与转录活性，抑制CD36驱动的炎症和代谢网络调控，促进胆固醇的转化与排泄。这说明，Nrf1是胆固醇稳态和对细胞过量胆固醇适应性反应的核心组成部分。因而，Nrf1可能是治疗胆固醇代谢相关疾病的一个新的潜在靶点，有待进一步研究。

4.2.2 神经退行性疾病 除了与胆固醇代谢相关疾病有关外，Nrf1的加工过程在蛋白质稳态缺陷引起的神经退行性疾病——脊髓和延髓性肌萎缩症(spinal and bulbar muscular atrophy，SBMA)中也具有重要作用。例如，Nath等[50]在研究SBMA模型小鼠(AR113Q)发病机制时发现，AR113Q蛋白可通过抑制DDI2阻止Nrf1的加工活化，进而引起泛素-蛋白酶体相关基因表达下调，致使蛋白质稳态失衡。因此，靶向Nrf1可能是治疗神经退行性疾病的有效方法，这一理念在Bott等[51]研究中得以体现。他们用姜黄素类似物ASC-JM17处理模型鼠时，发现该小分子药物可通过活化Nrf1/Nrf2改善SBMA的症状[51]。

上述研究表明，Nrf1翻译后加工修饰过程的异常在多种疾病的发生过程中发挥作用。因此，通过有效地靶向干预Nrf1剪切加工过程，调控Nrf1的活性以及下游靶基因的表达，或许将成为临床上疾病治疗的一个新策略。

5 问题与展望

Nrf1各亚型的产生受转录、翻译、翻译后修饰加工等过程中众多因素的调控，其产物分布于内质网、细胞质和细胞核多个区域，这些具有不同作用且多方位分布的亚型，必然从多个方面参与机体的生理性功能。尽管已对Nrf1生物学功能有了一定的了解，但仍然比较局限，有较多问题亟待解决：(1) 当前对Nrf1功能性亚型的鉴定主要是从蛋白质水平上的变化进行明确。然而非常遗憾的是，目前并无特异性抗体识别其亚型分子，即使是针对Nrf1本身而言，也无有效免疫组化抗体，这在一定程度上限制了Nrf1的研究范围；(2) 除了早期发现的几个亚型外，Ensembl数据库显示，Nrf1通过剪切加工产生了23个转录本，这些信息足以显示Nrf1在RNA水平上调控的复杂性。同时也表明，Nrf1在胞内发挥功能的重要性；然而，目前关于Nrf1 RNA水平上的剪切调控却是鲜有报道；(3) Nrf1作为蛋白酶体“反弹”效应的直接调控因子，为克服蛋白酶体抑制剂(例如bortezomib等)在临床运用上的耐药性提供新的契机，虽然通过干预Nrf1的翻译后修饰能提高此类化疗药物的敏感性，但蛋白酶体抑制剂活化Nrf1的上游机制仍不清楚，因而明确蛋白酶体“反弹”效应的上游机制，对于指导蛋白酶体抑制剂在实体瘤中的应用具有重要意义。值得一提的是，临床研究发现，Nrf1与阿尔兹海默症[52]、先天性去糖基化病[53]的发生具有很强的关联性，而且可作为恶性黑色素瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤[54, 55]的预后指标。总之，聚焦Nrf1并揭示其深层的调控机制势必为肿瘤、神经退行性疾病、代谢性相关疾病的治疗提供新方向。