基于三层高精度滴头制备一种胃肠道耐受型益生菌菌珠的研究

孙文轩

（上海华宝生物科技有限公司 上海 201821）

益生菌又称为益生素，具有多种对人体健康有益的生理功能，主要包括抑制致病菌定植、调节肠道菌群平衡、增强肠道上皮屏障功能、免疫调节和调节肠道神经系统的功能［1］。益生菌可以通过食用含有益生菌的相关保健品和益生菌发酵类产品获得［2］。据相关规定，在益生菌保健品中的活菌数最少要达到1×106CFU/mL［3］，而益生菌在人体内发挥益生作用必须满足有足够数量活的益生菌在肠道内定植这一前提条件［4］。但是，当口服益生菌经过消化道时，会在胃酸、胆盐、消化酶等的影响下失活，导致益生菌在人体的活菌数量远低于在人体发挥生理作用的最小理论值［5］。大多数肠道益生菌为厌氧型微生物，储存过程中与氧气和水分接触也其活性下降的原因之一。

益生菌微胶囊化是将细菌包埋在肠溶性壁材中，这些壁材在会肠道环境中降解，但是在胃部环境中能保持稳定［6］，这既增强益生菌对胃部逆环境的抵抗能力，也可以控制这些细胞在肠道中释放，显著提高益生菌到达肠道靶位点的存活率。微囊化包埋还可以给益生菌提供一个厌氧环境，隔绝氧气等外界不利因素，提高益生菌在贮存过程中的存活率。

常见的包埋方法有单层包埋法、双层包埋法及三层包埋法［7］。葛得龙等人［8］以海藻酸钠和N，O-壳聚糖为壁材，采用静电液滴法，制备海藻酸钠-羧甲基壳聚糖微胶囊包埋副干酪乳杆菌与游离的副干酪乳杆菌，微胶囊的胃肠消化的耐受性和耐储藏性显著提高。相对于未包埋的菌珠来说，单层包埋法虽然可以显著提高菌体的消化存活率和储存稳定性，但是也存在干燥损失及包埋率低等不足。双层包埋是针对单层包埋的不足进行再设计，在微胶囊中加入冻干保护剂或益生元，以及在微囊表面进行包衣，增强对菌种的保护力度［9］。张瑞采用内源乳化法包埋鼠李糖杆菌，制备了“果胶+明胶/乳清分离蛋白双层微胶囊”，包封率高达89.3%。双层包埋虽然在一定程度上避免了菌的泄漏，提高干燥过程中的菌活，但是菌粉往往在未达到肠道就已经被分解失活，无法实现微囊在肠道的控释。三层包埋比双层包埋有更强的耐胃酸性和坚固性。柳永［10］等人采用w-o-w 的三层包埋方式对干酪乳杆菌进行包埋，第一层为包含卡拉胶和益生元的水凝胶，第二层为棕榈油，第三层为海藻酸钠、碳酸钙及黄原胶。该方法制备的益生菌微胶囊具有良好的热稳定性及储藏稳定性，并且实现了益生菌的定性释放，但是由于三层包埋工艺的复杂性及包埋层厚度难以控制，导致其难以实现工业化。

滴丸技术可通过滴头挤压胶液将药物包裹起来形成微胶囊，常用于脂溶性药物或益生菌等的包埋，且具有装量精确、恒定、可操作性强等优点［11-12］。利用高精度多重同心圆滴丸技术，可以轻松实现三层包埋技术，制备三层包埋的益生菌菌珠。

目前，市面上大部分益生菌制剂及公开的益生菌微囊包埋技术始终有一个共性难题还未解决，就是产品在加工、储藏和使用过程中活菌数下降和活性降低的问题，并且缺乏对益生菌胃肠道靶向递送的关注［13］。益生菌微囊化包埋作为提高益生菌储存稳定性和胃酸耐受性及肠道靶向释放细胞的方法，越来越受到人们的重视，成为当今研究的热门课题。

本研究拟采用同心滴丸技术，以复合凝胶为壁材，以固态脂质为保护层，包裹包含益生菌的油性悬浮液，制备一种可以抵抗胃肠消化和耐存储的益生菌菌珠，可以解决益生菌贮存和服用过程中活性、数量及效价损失严重的问题，并实现微胶囊的靶向释放，具有广泛的应用价值。

1 实验材料

1.1 材料与试剂

副干酪乳杆菌购自中国金华，葵花籽购自当地超市，单、双甘油脂肪酸酯，棕榈油购自益海嘉里，MRS琼脂培养基、明胶、海藻酸钠购自阿拉丁，胃蛋白酶、脂肪酶、胰酶、胆盐购自Sigma，浓盐酸、氯化钙、氯化钠等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

高精度同心滴丸机（滴头自制）、厌氧培养箱（YQX-T）、立式压力蒸汽灭菌锅（ZDX-35BI）、超净工作台（SW-CJ-1D）、恒温振荡器（SHZ-82）、涡旋振荡器（XH-C）、数显恒温磁力搅拌水浴锅（HCJ-4A）、电子分析天平（AL204）。

2 实验方法

2.1 益生菌珠的制备

2.1.1 高精度同心滴丸机

采用高精度同心滴丸机制备益生菌珠，滴丸机基本结构如图1 所示，其中，1、2、3 分别连接着盛放含有益生菌的液态油相、固态脂质及胶液的储料罐，为液态菌油、固态脂质、胶液的入口，由物料泵将各相物料泵入滴头；结构4为三相同心滴头，由内到外分别是液态菌油、固态脂质和胶液；结构5 为冷却循环系统，菌珠在该段冷却成型；结构6为冷却液保护套。

图1 三层同心滴丸设备滴头示意图

2.1.2 液态菌油、固态脂质及胶皮相的制备

先按比例称取适量明胶、海藻酸钠溶于灭菌水中，65℃水浴加热搅拌3h至完全溶解后保温除去气泡，制备成胶液待用。将单、双甘油脂肪酸酯作为分散剂按比例加入葵花籽油中，于60℃水浴下加热搅拌30min至完全溶解，冷却至37℃左右后加入1%（w/w）的副干酪乳杆菌冻干菌粉，经分散机5000rpm分散3min，制备成均匀的液态菌油相保温备用。将44℃棕榈油在50℃水浴中搅拌溶解作为固态脂质相50℃保温待用。

2.1.3 益生菌珠的制备

将液态菌油、固态油相和胶皮相分别置于高精度同心滴丸设备的储料罐中，调节机械参数：胶液罐温度为65～70℃，固态脂质罐温度为45～50℃，液态菌油罐温度30～35℃，滴头温度为50～60℃，制冷温度为6～7℃，液态菌油泵、固态脂质泵和胶液泵的转速比为5：4：2。三相物料经过如图1 所示的三层同心圆滴头流出后，由脉冲装置快速切割成益生菌珠，再通过6～7℃冷却循环系统对菌珠进一步冷却和定型，将成型的益生菌珠置于氯化钙溶液中交联30min后过滤，用蒸馏水清洗3次除去多余的钙离子，即得到湿胶囊。将湿胶囊置于温度为25℃、相对湿度为40%的恒温恒湿环境下进行干燥，即得三层包埋结构的益生菌珠，从内到外依次是液态油相、固态脂质保护层和胶皮外壳。

按照上述方法，分别制备分散有副干酪乳杆菌的液态油相的三层包埋益生菌珠和不含固态脂质保护层的双层包埋益生菌珠。

2.2 益生菌珠尺寸的测量

观察干燥微胶囊的形态并拍照，通过游标卡尺测量100 个益生菌菌珠来评估微胶囊的平均尺寸、固态脂质保护壳层厚度和胶皮层厚度［14］。首先，菌珠测量外径；然后，小心剥去胶皮外衣，测量固态脂质体保护壳层包裹的菌珠的直径；最后，将剩下的部分平均切开，称量其中液态油相的质量，根据其密度，计算出芯液的体积及半径。因此，固体脂质体保护壳层厚度和胶皮膜层厚度的计算公式如下：

式中，Tg为外层胶皮相的厚度（mm）；Tsl为固态脂质保护壳的厚度（mm）；dext为益生菌菌珠的外径（mm）；d为固态脂质保护壳包裹的菌珠的外径（mm）；dint为益生菌菌珠的内径，即液态油相的直径（mm）。

2.3 益生菌在加工过程中稳定性

在菌珠制备过程中，高温及水分等不良因素会导致益生菌失活。为了探究菌珠在加工过程中对益生菌的保护作用，分别从三层包埋和双层包埋菌珠的液态油相及未经过滴头的分散有副干酪乳杆菌的液态油相中取样，用含有5%吐温-80 的生理盐水连续稀释，接种于MRS 琼脂培养基，在37℃下厌氧培养48h 计算菌落总数。

2.4 益生菌珠在体外模拟消化中的稳定性

益生菌从口腔摄入后，经过胃及小肠环境后在结肠定植并发挥作用。为了探究益生菌珠对模拟胃液及肠液消化的耐受性，本研究采用Minekus［15］的消化模型稍加改进进行体外模拟消化。

2.4.1 消化液的配置

模拟胃部消化液（SGF）的配置：取0.7mL 浓盐酸，200mg 氯化钠溶解并定溶于100m 蒸馏水中，并提前45min加入3.2mg/mL胃蛋白酶，于37℃加热搅拌溶解。

模拟小肠消化（SIF）的配置：取10.94g 氯化钠，1.835g一水合氯化钙，溶解并定溶于100mL蒸馏水中。

2.4.2 模拟体外消化

分别取三层包埋、双层包埋及液态油相菌液1g加入到15mL 模拟胃部消化液中，调节pH 值至2，在37℃、100r/min的条件下水浴震荡消化2h后，取出胃部消化液，加入1.5mL 模拟小肠消化液、3.5mL 胆盐（含189mg胆盐，用5mM PBS缓冲溶液配置），调节pH值至7，加入2.5mL 脂肪酶（含60mg 脂肪酶，用5mM PBS 缓冲溶液配置）、2.5mL 胰酶（含60mg 胰酶，用5mM PBS缓冲溶液配置），在37℃、100r/min条件下消化2h，由于脂肪被脂肪酶水解成脂肪酸，而导致消化体系pH值下降，因此，每隔30min将体系pH值调节至7.0，分别从胃消化和肠消化结束后的益生菌菌珠中取样，进行梯度稀释后，经过MRS 琼脂培养基在37℃厌氧培养48h 计算菌落总数，并对每个消化阶段结束后的益生菌菌珠的形貌进行观察。

2.5 益生菌珠的储藏稳定性

分别将三层包埋和不含固态脂质保护层的双层包埋菌珠置于4℃及室温条件下储存12 个月，每隔一段时间取样培养，计算益生菌的活菌数。

2.6 数据统计与分析

每个实验重复3次，各组数据用SPSS 25软件进行分析，以P＜0.05 作为差异作为著性判断标准，结果以“平均值±标准差”表示，图表用origin绘制。

3 结果与分析

3.1 益生菌珠的外观

如图2所示，菌珠为大小均匀的白色圆球，其中包含三层保护结构，从内到外分别是：负载益生菌的液态油相、固态脂质体保护层及外层胶皮。固态脂质及明胶和海藻酸钠的双网络凝胶胶皮共同支撑起菌珠的球形结构。菌珠的直径尺寸如表1 所示，含有固态脂质保护层的三层包埋菌珠的平均直径和液态油相芯液的平均直径分别为（4.37±0.12）mm 和（2.63±0.09）mm 胶皮层、固态脂质保护层的平均厚度分别为0.2mm 和0.66mm。不含固态脂质保护层的双层包埋益生菌珠的平均直径和液态油相内芯的平均直径分别为（3.05±0.07）mm 和（2.57±0.06）mm，胶皮层的平均厚度为0.24mm，该菌珠尺寸适合吞服使用。

图2 益生菌珠的外观结构

表1 益生菌珠的尺寸

3.2 益生菌在加工过程中的稳定性

测定干燥后菌珠的益生菌活性，结果如图3所示，包含固态脂质保护层的三层包埋菌珠的菌活显著高于不含固态脂质保护层的双层包埋菌珠，分别为（8.97±0.01）lgCFU/g 和（8.73±0.02）lgCFU/g，菌体存活率为（87.48±2.41）%和（50.39±2.86）%。菌珠制备过程中，液态油相芯液的温度为30～37℃，固态脂质保护层的温度为45～50℃，外层胶皮的温度为60～75℃。液态油相中的副干酪乳杆菌在与胶皮层直接接触时因高温而失活，在液态油相芯液与高温胶皮相之间释放较低温的固态脂质作为保护层，避免益生菌与胶皮直接接触，显著提高了益生菌的菌活。同时，固态脂质保护层还可以阻挡菌珠浸泡氯化钙溶液及干燥过程中水分进入菌珠内部，降低因水分导致的益生菌失活。

图3 液态菌油和益生菌珠在干燥后活菌数

3.3 益生菌珠在体外模拟消化中的稳定性

将负载有副干酪乳杆菌菌粉的液态油相芯液及菌珠经过模拟胃液和模拟肠液的连续处理，测定它们在经过模拟胃液和模拟肠液消化后的活菌数和存活率，结果如图4和表2所示。经过模拟胃液消化后，未经包埋的液态菌油、三层包埋菌珠及双层包埋菌珠的菌活分别降低为（7.26±0.08）lgCFU/g、（8.89±0.01）lgCFU/g和（8.51±0.03）lgCFU/g。副干酪乳杆菌的对环境敏感，液态菌油直接分散在pH=2的模拟消化液中，副干酪乳杆菌在胃酸和胃白酶的作用下基大量死亡［16］，其菌体存活率显著低于两组菌珠样品。对比两组菌珠经过胃消化液后的菌体存活率发现，三层包埋菌珠在胃酸环境中的稳定性显著高于双层包埋菌珠，存活率分别为（82.31±1.42）%和（60.26±4.04）%。菌珠在胃液中发生溶胀，胶皮表面产生小孔，胃酸渗透凝胶层，三层包埋菌珠由于固态脂质隔绝了环境中的胃酸，为芯液中的益生菌提供了保护作用。

图4 菌油和菌珠在模拟消化过程中的菌活

表2 益生菌在模拟消化过程中的存活率

模拟肠消化过程中，在消化酶的作用下，菌珠的胶皮被酶解，由于没有固态脂质的支撑，液态菌油直接分散在消化液中，副干酪乳杆菌在消化酶和胆盐的作用下活性降低，小肠消化2h后菌活为（8.18±0.04）lgCFU/g，菌存活率为（28.12±2.43）%。与此相比，三层包埋菌珠的胶皮和部分固态脂质保护层被酶解，但是在固态脂质的支撑下还能保持球形包埋结构，模拟肠消化结束后菌活为（8.68±0.03）lgCFU/g，菌存活率为（51.58±4.12）%，显著提高了益生菌在模拟肠消化过程中的稳定性。相比于采用凝胶直接包埋液态菌油的双层包埋技术，在液态菌油和胶皮之间增加一层固态脂质，可以保护液态油相中的益生菌抵抗部分部分胃酸、消化酶及胆盐的损害，提高益生菌的在消化过程中的存活率。而且在固态脂质中添加肠道粘附因子和益生元，还可以促进益生菌在肠道的粘附和定植，实现益生菌的靶向释放和结肠定植。

3.4 益生菌珠的储藏稳定性

将个菌珠分别置于4℃和常温下储藏12 个月，每隔3 个月测定菌珠的活菌数，结果如图5 所示，菌体存活率如表3 所示。无论是在4℃，还是在室温条件下，随着储藏时间的延长，两种菌珠的菌活均显著下降，但含有固体脂质保护层的三层包埋菌珠的菌活普遍高于双层包埋菌珠，在4℃储藏12 个月后，菌活高达（8.78±0.02）lgCFU/g，室温下储藏12月后，菌活仍有（8.69±0.02）lgCFU/g。而仅由水凝胶包埋液态菌油的双层包埋在4℃和室温下储藏12 个月后，菌活分别从（8.67±0.04）lgCFU/g 降 低 为（8.06±0.13）lgCFU/g 和（7.84±0.01）lgCFU/g，储藏稳定性显著低于三层包埋的菌珠。因为液态油相、固态脂质层及凝胶层的协同屏障作用，可以将益生菌与“水分”“氧气”等外界不良环境因素隔绝开，显著提高益生菌的储藏稳定性［17］。4℃储藏的菌珠菌活普遍高于室温下储藏的菌活，低温环境更有利于菌珠的储藏。

表3 菌珠在储藏过程中的菌体存活率

图5 益生菌珠的储藏稳定性

4 结语

本研究采用高精度同心滴丸技术包埋副干酪乳杆菌，制备了一种o-o-w三层包埋的益生菌珠，菌珠从里到外分别是液态菌油、固态脂质体保护层和胶皮相，干燥菌珠的平均直径为（4.37±0.12）mm，胶皮层的平均厚度为0.20mm，固体脂质体保护层的厚度0.66mm，液态油相内芯的平均直径为（2.63±0.09）mm，其活菌数为（8.97±0.01）lgCFU/g，显著高于o-w 双层包埋菌珠。在传统的o-w 双层包埋菌珠中增加固态脂质层，可以显著降低由于菌珠制备过程中高温和水分导致的益生菌失活，并且提高益生菌在胃肠道消化及储藏过程中的稳定性，为解决益生菌不耐胃酸和储藏稳定性差的问题提供了一个新思路。