固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定植物油脂中香兰素

徐彦辉

(安徽省公众检验研究院有限公司，合肥 230051)

植物油脂包括菜籽油、花生油、芝麻油等很多种类，是人们日常生活中必需的食品。随着生活水平的提高，消费者对植物油的质量安全也越来越关注。目前，我国还没有关于植物油脂中香兰素含量测定的国家标准。

香兰素，又名香草醛，化学名称为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，是从芸香科植物香荚兰豆中提取的一种有机化合物。香兰素是一种可食用的香精，用来增加食物的香气，让食物更加美味和清香；被广泛应用于食品中，但是过量摄入香兰素会导致头晕、恶心、呼吸困难，甚至损伤肝、肾[1]。目前GB 2760—2014 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中严格规定了香兰素的使用限量，并且规定了植物油脂、动物油脂等食品中不得添加。然而，不法商贩为了达到以次充好、以假乱真的目的，在食品中违法添加此类物质。“香精奶粉”、“香精油”等事件引起了广泛关注。因此，基于日常监管需要，建立相应的检测方法迫在眉睫。香兰素的检验方法有液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等[1]，植物油脂中香兰素检测研究较少。植物油脂中脂肪含量高，不易净化，因此需要采用合适的提取、净化方法才能准确测定植物油脂中的香兰素含量[2-5]。笔者选择2%氢氧化钠溶液作为提取溶剂，采用阴离子固相萃取柱进行净化，利用液相色谱-串联色谱法测定植物油脂中香兰素含量，方法快捷，测量精密度、准确度满足要求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：4500 型，美国AB 公司。

去离子水发生器：Milli-Q 型，美国密理博公司。

电子天平：XP205 型，感量0.01 g，瑞士梅特勒托利多公司。

甲醇、甲酸、乙酸乙酯、环己烷：均为色谱纯，美国天地试剂公司。

微孔滤膜：孔径为0.22 μm。

阴离子固相萃取柱：PAX 型，500 mg/3 mL，艾杰尔公司。

香兰素标准品：纯度大于99% (质量分数)，德国Dr. Ehrensorfer 公司。

香兰素标准储备液：1 mg/mL，精确称取香兰素10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于-20℃冰箱中保存。根据实际需要用色谱流动相将标准储备液稀释成适合的标准工作溶液，现用现配。

植物油脂样品：市售芝麻油、菜籽油、大豆油。实验用水为去离子高纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱

色谱柱：Eclipse Plus C18RRHD 柱(50 mm×3.0 mm，1.8 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：A 相为0.1%甲酸水溶液，B 相为甲醇，流量为0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：3.0 kV；去溶剂温度：450 ℃；气体流量：800 L/min；定性离子：m/z93；定量离子：m/z125；碰撞能量等参数见表2。

表2 多反应监测模式(MRM)参数

1.3 样品处理

称取约1 g 植物油脂样品(精确至0.01 g)于10 mL 离心管中，加入0.5 mL 二氯甲烷，再加入3 mL 2%氢氧化钠溶液，涡旋提取10 min，以8 000 r/min 转速离心5 min，移出上层水相；残余物再用3 mL 2%氢氧化钠溶液重复提取一次，合并水相。

用3 mL 甲醇、3 mL 2%氢氧化钠溶液活化固相萃取柱，然后将提取液上固相萃取柱，调节流量为1～2 滴每秒，待全部溶液通过SPE 小柱后，依次用6 mL超纯水、6 mL甲醇淋洗，弃去流出液；用6 mL 5%甲酸-甲醇洗脱目标物，收集流出液。将流出液于40 ℃水浴下氮气吹干，用1 mL 初始流动相定容，过0.22 μm 滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

由文献可知，油脂的检测方法中提取溶剂多为甲醇、乙腈及碱性溶液(例如2%氢氧化钠溶液)等，净化方式有直接提取浓缩、固相萃取柱净化[6-9]。

分别以甲醇、乙腈、2%氢氧化钠溶液作为植物油脂样品中香兰素的提取溶剂，试验比较了目标物的提取效果。结果发现，甲醇和乙腈虽然能够有效地提取香兰素，但同时会提取出较多的油脂，特别是采用溶剂提取后直接进样测定，提取液中残留的油脂及其它干扰物质较多，容易造成基质效应及质谱仪污染。而且直接进样提取液中甲醇含量太高，进样后易造成溶剂扩散，香兰素的色谱峰形不对称，特别是当样品中香兰素含量较小时影响更加明显。

当采用2%氢氧化钠溶液提取时，香兰素在碱性环境中成离子状态，在水溶液中的溶解性增强，能够更好地与油脂分离，再采用阴离子固相萃取柱净化，该净化方式能够有效去除油脂等其它干扰物质，且使用初始流动相消除了有机相比例过大造成的溶剂效应影响，净化回收率为85.6%～111%，能够快速、准确测定动植物油脂中香兰素含量。

提取过程中加入0.5 mL 二氯甲烷能够让油脂中非极性成分集中到二氯甲烷层，因为二氯甲烷密度比水大，经过涡旋离心后二氯甲烷和2%氢氧化钠溶液会产生分层，这样在提取过程中加入二氯甲烷能够除去部分油脂中非极性物质，有利于减轻固相萃取柱净化压力，同时能够更好的消除基质效应的影响。

2.2 净化条件的优化

香兰素分子结构中含有芳香醛基，在碱性环境下易成阴离子状态，因此可以采用阴离子固相萃取柱净化，碱性提取溶液中离子状态的香兰素被阴离子固相萃取柱吸附后，再用纯水和甲醇依次淋洗，能够去除盐分及脂质色素等大分子物质干扰，再用酸性甲醇进行洗脱，氮气吹干后供液相色谱-串联质谱仪分析[10-15]。

选择实验室常见的PAX 型阴离子固相萃取柱，为了确定合适的甲醇中甲酸浓度，用2%氢氧化钠溶液配制10 ng/mL 香兰素溶液，取5 mL 香兰素溶液分别进样至3 根PAX 固相萃取柱(固相萃取柱已用3 mL 甲醇、3 mL 2%氢氧化钠溶液活化)中，依次用6 mL 超纯水、6 mL 甲醇淋洗，弃去流出液后，再分别用1%甲酸-甲醇、3%甲酸-甲醇、5%甲酸-甲醇各6 mL 进行洗脱，将流出液于40 ℃水浴下氮气吹干，用1 mL 初始流动相定容，过0.22 μm 滤膜后供液相色谱-串联质谱测定，香兰素的回收率如图1 所示。由图1 可知，用5%甲酸-甲醇作为洗脱溶液，香兰素的回收率最高，且接近100%，因此选择5%甲酸-甲醇作为洗脱溶液。

图1 不同浓度甲酸-甲醇洗脱时香兰素的回收率

为了确定合适的洗脱体积，采用2%氢氧化钠溶液配制10 ng/mL 香兰素溶液，取5 mL 香兰素溶液进样至已活化的PAX 固相萃取柱中，经过6 mL超纯水、6 mL 甲醇淋洗后，用5%甲酸-甲醇进行洗脱，每2 mL 收集一次，即分别收集2、4、6、8、10 mL 时的分段流出液，将流出液于40 ℃水浴下氮气吹干，用初始流动相定容后供液相色谱-串联质谱仪测定，结果表明，当洗脱体积为6 mL 时已完全洗脱，8 mL、10 mL 时的分段流出液中无香兰素，故选择下洗脱液用量为6 mL。

2.3 质谱条件优化

配制1 μg/mL 的香兰素标准溶液，利用Analyst软件(美国AB SCIEX 公司)自动优化得到香兰素的子离子、传输电压及碰撞能量，具体参数见表2。

2.3.1 去溶剂温度的优化

去溶剂气就是利用高温的惰性气体使喷雾毛细管尖端的流动相溶剂蒸发并通过气流带走，从而使带电雾滴变小，然后进一步通过带电雾滴间的碰撞不断发生库仑爆炸，最终由很小的带电雾滴产生气相离子[16-18]。较高的去溶剂温度有助于提高溶剂、离子蒸发气化，比较了在400、450、500、550、600 ℃去溶剂温度，结果表明去溶剂温度在450 ℃时香兰素的响应值最高，因此选择香兰素的去溶剂温度为450 ℃。

2.3.2 去溶剂流量的优化

物质的离子化过程不仅跟去溶剂的温度有关系，还与气体流量有关系，只有在最优条件下，物质的离子化效率才会最高。分别考察了去溶剂流量为600、700、800 L/min 时香兰素的响应值，结果表明，去溶剂流量在800 L/min 时香兰素的响应值最高，去溶剂流量优化的结果为800 L/min。

2.3.3 电离电压的优化

物质的离子化过程还与电离电压有关系，整个离子化过程在电离电压、去溶剂温度以及去溶剂流量的共同作用下，使物质离子化，形成带电荷的离子，因此电离电压也需要优化。比较了香兰素在1.0、2.0、3.0、4.0 kV 不同电离电压下的响应值，结果表明，电离电压在3.0 kV 时香兰素响应值最高，因此电离电压的优化结果为3.0 kV。

最终选择去溶剂温度、去溶剂气体流速及合适电离电压的最优条件分别为450 ℃、800 L/min及3.0 kV。图2～图4 为空白样品、10 μg/L 标准溶液、10 μg/kg 加标样品中香兰素的多反应监测色谱图。

图2 空白样品的多反应监测色谱图

图3 10 μg/L 标准溶液的多反应监测色谱图

图4 10 μg/kg 加标样品的多反应监测色谱图

2.4 线性方程、线性范围与检出限

配制1、2、5、10、50 μg/L 的香兰素系列标准工作溶液，按1.2 仪器工作条件测定。以目标物定量离子的色谱峰面积为y轴，香兰素的质量浓度为x轴，绘制标准工作曲线。实验结果表明，在1～50 μg/L范围内，香兰素的定量离子的色谱峰面积与对应标准溶液的质量浓度线性关系良好，线性方程为y=15 623x-3 125，相关系数为0.999 6。

以空白样品添加不同浓度的香兰素标准溶液，经过前处理后按照优化条件上机测定，以信噪比S/N为3 时对应的溶液质量浓度为方法检出限，并依据稀释倍数计算得出植物油脂中香兰素的检出限为1.0 μg/kg。

2.5 加标回收与精密度试验

分别准确称取6 份植物油脂样品，分别添加10、50 μg/kg 香兰素标准品，按本方法进行加标回收试验，结果列于表3。由表3 可知，6 份样品两水平的平均加标回收率为102.5%和98.4%，测定结果的相对标准偏差为7.1%和8.6%。该方法的精密度和准确度满足分析要求。

表3 油脂样品加标回收试验结果

3 结语

建立了检测植物油脂中香兰素含量的凝胶渗透色谱-液相色谱-串联质谱法。该法操作简便，定性、定量准确，重复性好，灵敏度高，样品前处理过程简便快捷，可满足实验室大量、快速分析的需求。