CTRP9对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的干预效果及作用机制研究

谢骏 温鑫 高凤敏 杨骄霞 郭继芳

急性心肌梗死是一种临床常见的心肌组织细胞坏死性疾病，其主要诱因为冠状动脉持续性供血、供氧不足，患者主要临床表现为长时间的胸骨后剧烈疼痛[1，2]。我国每年新增急性心肌梗死病例数居高不下。溶栓、手术、介入等均为临床常用的治疗手段，有学者表示，部分急性心肌梗死患者治疗过程中出现心肌组织损伤程度加剧的情况，即为再灌注损伤，有研究表明，再灌注损伤会使患者心肌损伤程度更加严重，严重威胁患者生命安全[3，4]。目前临床尚无特效的治疗心肌缺血再灌注损伤的手段，因此越来越多的专家学者开始致力于心肌缺血再灌注损伤治疗方法的研究[5]。CTRP9 是一种新型脂肪因子，主要表达于机体心肌组织，具有抗炎、促进血管舒张等作用，但是关于其在心肌缺血再灌注损伤中的研究鲜有报道[6]。本研究建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，调控CTRP9 表达，旨在探究CTRP9 对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的干预效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料选取40 只SD 健康雄性大鼠[哈尔滨国生生物科技股份有限公司，使用许可证号：SYXK（黑）2021-002]，年龄10～14 周，平均（11.9±1.7）周；体重235～279g，平均（257.3±17.6）g。所有大鼠于（22.9±1.5）℃环境中喂养。本研究获我院伦理委员会批准。

主要试剂：ago CTRP9、antago CTRP9（上海国药集团化学试剂有限公司）；大鼠抗小鼠TNF-α、IL-6 抗体（Gibco 公司）；小鼠抗兔LPO、CAT 抗体（Hyclone 公司）；兔抗大鼠Wnt3a、β-catenin 抗体（Invitrogen 公司）；大鼠抗小鼠AMPK 抗体（Selleck公司）；兔抗大鼠p38MAPK 抗体（BD 公司）；小鼠抗兔PPARγ 抗体（Sigma 公司）。

1.2 分组干预随机选取10 只大鼠为正常组，不做处理。其余30 只大鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型：麻醉处理大鼠，使用心电图对大鼠进行心电监测。于大鼠左胸第4 肋间隙开胸，使大鼠心脏显露于术野，将大鼠左心耳下2mm 位置左冠状动脉前降支结扎，同时观察心电图，ST 段抬高表示缺血建立成功，45min 后将结扎缝线去除，再灌注2h。建模过程中大鼠死亡3 只，建模成功27 只。将27只心肌缺血再灌注损伤大鼠随机分为模型组、下调组、上调组各9 只，下调组大鼠腹腔注射antago CTRP9 30mg/kg，上调组大鼠腹腔注射ago CTRP9 30mg/kg，正常组、模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水。

1.3 指标监测

1.3.1 LVEDd、LVESd 水平检测 对各组大鼠进行麻醉处理，剃除大鼠胸部体毛，以30°仰卧体位进行固定，将超声探头置于左胸骨，与中线夹角20°，对大鼠LVEDd、LVESd 水平进行检测。

1.3.2 酶标分析仪检测氧化应激、炎症指标水平 取各组大鼠腹部静脉血3ml，2 000r/min 离心15min后-50℃保存。标记酶标板，准备标准品并进行稀释，设置三孔分别标记为对照1、对照2、观察孔，对照1 孔加入显色剂及终止液，对照2 孔加入制备的标准品，观察孔加入血清标本及抗体，三孔封膜、振荡后置于37℃保温箱培养2.5h，添加显色剂，显色后添加终止液，计算LPO、CAT、TNF-α、IL-6 水平。

1.3.3 HE 染色 各组大鼠全麻处理，采用颈部脱臼法处死，取大鼠心脏组织进行清洗，固定后浸泡于4%甲醛1d，石蜡包埋、切片后脱蜡，使用不同浓度酒精复水，清洗3min 后苏木素染色，之后进行分化、氨水蓝化，冲洗后伊红染色、乙醇梯度脱水、脱蜡后封片，显微镜下观察。

1.3.4 心肌梗死体积、心肌细胞凋亡率计算 取各组大鼠心肌组织切片，置于1% TTC 溶液中，在室内避光环境中孵育0.5h，使用BI-2000 医用图像分析系统对梗死体积百分比进行计算。TUNEL 法检测心肌组织细胞凋亡率。

1.3.5 Wnt/β-catenin 通路、AMPK/p38MAPK/PPAR通路蛋白相对表达量检测 使用Western blot 法检测。裂解待测标本，提取50μg 蛋白，蛋白定量后行SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜，封闭2h 后添加一抗（1:2000）4℃孵育1d，使用PBS 液清洗3 次后添加二抗（1:5000），孵育1h 后PBS 液清洗3 次，显色、曝光、成像，检测条带灰度值，计算Wnt3a、β-catenin、AMPK、p38MAPK、PPARγ 相对表达量。

1.4 统计学方法使用SPSS 26.0 软件分析，计量资料以±s描述，多组对比行F检验，组间对比行独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理学观察正常组大鼠心肌组织细胞形态规则、正常，排列整齐紧密，无细胞破损情况；模型组、下调组大鼠心肌组织细胞排列杂乱，出现较多胶原纤维，且出现严重的细胞膜受损情况；上调组大鼠心肌组织细胞排列杂乱情况明显改善，炎性细胞减少。见图1。

2.2 各组大鼠LVEDd、LVESd 水平比较模型组、下调组大鼠LVEDd、LVESd 水平高于正常组，且下调组大鼠LVEDd、LVESd 水平高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；上调组大鼠LVEDd、LVESd 水平低于模型组、下调组，高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠LVEDd、LVESd 水平比较（±s，mm）

表1 各组大鼠LVEDd、LVESd 水平比较（±s，mm）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与下调组比较，cP＜0.05

组别 n LVEDd LVESd正常组 10 6.65±0.67 4.21±0.35模型组 9 10.63±1.58a 7.15±0.82a下调组 9 13.47±2.12ab 8.62±1.29ab上调组 9 8.52±1.05abc 5.32±0.55abc

2.3 各组大鼠氧化应激、炎症指标水平比较模型组、下调组大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于正常组，CAT 水平低于正常组，且下调组大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于模型组，CAT 水平低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；上调组大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于正常组，低于模型组、下调组，CAT 水平低于正常组，高于模型组、下调组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠氧化应激、炎症指标水平比较（±s）

表2 各组大鼠氧化应激、炎症指标水平比较（±s）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与下调组比较，cP＜0.05

组别 n LPO（mmol/L）IL-6（pg/ml）正常组 10 5.26±0.85 83.29±9.15 3.19±0.61 6.58±0.79模型组 9 15.33±2.34a 63.05±6.54a 12.28±2.27a 19.33±2.53a下调组 9 19.18±2.67ab 52.19±6.13ab 16.41±2.52ab 24.16±2.79ab上调组 9 8.12±1.52abc 75.13±8.52abc 5.63±1.52abc 11.21±1.78abc CAT（U/ml）TNF-α（ng/L）

2.4 各组大鼠心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率比较模型组、下调组大鼠心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率高于正常组，且下调组大鼠心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；上调组大鼠心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率低于模型组、下调组，高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率比较（±s，%）

表3 各组大鼠心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率比较（±s，%）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与下调组比较，cP＜0.05

组别 n 梗死体积比例 凋亡率正常组 10 0.00±0.00 3.98±0.64模型组 9 35.26±4.17a 19.52±2.33a下调组 9 41.32±4.53ab 25.16±2.68ab上调组 9 16.37±2.76abc 9.68±1.21abc

2.5 各组大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表达比较模型组、下调组大鼠Wnt3a、β-catenin 表达高于正常组，下调组大鼠Wnt3a、β-catenin 表达高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；上调组大鼠Wnt3a、β-catenin 表达高于正常组，低于模型组、下调组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图2。

表4 各组大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表达对比（±s）

表4 各组大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表达对比（±s）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与下调组比较，cP＜0.05

组别 n Wnt3a β-catenin正常组 10 0.98±0.11 1.02±0.15模型组 9 1.63±0.25a 1.65±0.23a下调组 9 1.86±0.32ab 1.89±0.29ab上调组 9 1.21±0.16abc 1.25±0.19abc

2.6 各组大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表达对比模型组、下调组大鼠AMPK、PPARγ 表达低于正常组，p38MAPK 表达高于正常组，且下调组大鼠AMPK、PPARγ 表达低于模型组，p38MAPK表达高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；上调组大鼠AMPK、PPARγ 表达低于正常组，高于模型组、下调组，p38MAPK 表达高于正常组，低于模型组、下调组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表5、图3。

表5 各组大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表达对比（±s）

表5 各组大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表达对比（±s）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与下调组比较，cP＜0.05

组别 n AMPK p38MAPK PPARγ正常组 10 1.01±0.12 1.05±0.14 0.98±0.10模型组 9 0.62±0.07a 1.56±0.22a 0.53±0.06a下调组 9 0.49±0.06ab 1.82±0.25ab 0.41±0.05ab上调组 9 0.85±0.09abc 1.23±0.16abc 0.75±0.08abc

3 讨论

作为常见的心血管疾病，急性心肌梗死具有发病急、预后差的特点[7]。中老年人群为急性心肌梗死高发群体，急性心肌梗死已经成为威胁中老年人群生命安全的主要疾病。临床常使用介入、溶栓等手段对急性心肌梗死患者进行治疗，但具有一定的再灌注损伤风险，再灌注损伤也是影响急性心肌梗死患者预后的主要因素[8，9]。有研究表明，心肌缺血再灌注损伤是一种较复杂的病理过程，病情严重的会导致不可逆的心肌组织细胞凋亡[10，11]。CTRP9是一种新型脂肪因子，具有保护内皮细胞、扩张血管、抗炎等多种作用。CTRP9 表达变化与急性心肌梗死严重程度具有密切联系，但是关于其在心肌缺血再灌注损伤病理发展过程中作用的研究还鲜有报道。

心肌缺血再灌注损伤的发生发展会导致心室重构，对机体心功能造成严重威胁[12，13]。有学者在研究中表示，心肌缺血再灌注损伤的严重程度与机体左室功能具有密切联系[14]。LVEDd、LVESd 常用于评价机体心功能。本研究显示，与正常大鼠相比，心肌缺血再灌注损伤模型大鼠LVEDd、LVESd 水平较高，说明随着心肌缺血再灌注损伤的发展，大鼠出现心室重构，心功能受到明显损伤。本研究还发现，上调CTRP9 表达的心肌缺血再灌注损伤大鼠LVEDd、LVESd 水平明显下降，说明上调CTRP9 表达能够改善大鼠心室重构状况，从而促进大鼠心功能恢复，可能是因为CTRP9 能够缓解动脉粥样硬化、扩张血管，从而改善心肌梗死、再灌注损伤严重程度。

有研究表明，氧化应激、炎症反应均为心肌缺血再灌注损伤发展的主要诱因，抑制机体心肌组织氧化应激、炎症反应，能够减轻心肌缺血再灌注损伤严重程度，对机体心功能恢复、预后改善具有积极作用[15，16]。本研究显示，心肌缺血再灌注损伤模型大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平较高，CAT 水平较低，上调CTRP9 表达的心肌缺血再灌注损伤大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平明显下降，说明心肌缺血再灌注损伤症状的发展伴随着一定程度的氧化应激、炎症反应，上调CTRP9 表达能够减轻氧化应激、炎症反应严重程度，从而抑制心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织损伤，起到改善大鼠心功能的作用。

心肌缺血再灌注损伤的发生发展伴随着心肌细胞凋亡，从而造成大鼠心功能严重损伤[17]。本研究显示，心肌缺血再灌注损伤模型大鼠凋亡率较高，上调CTRP9 表达的心肌缺血再灌注损伤大鼠梗死体积比例、凋亡率明显下降，说明上调CTRP9 表达能够改善大鼠心肌组织损伤严重程度，抑制心肌组织细胞凋亡，可能是因为上调CTRP9 表达调控细胞凋亡通路蛋白表达。Wnt/β-catenin 为广谱的细胞凋亡通路，主要配体Wnt3a、β-catenin 表达与细胞凋亡、增殖能力变化密切相关[18，19]。本研究显示，心肌缺血再灌注损伤大鼠Wnt3a、β-catenin 相对表达量较高，上调CTRP9 表达的心肌缺血再灌注损伤大鼠Wnt3a、β-catenin 相对表达量明显下降，说明上调CTRP9 表达能够调控Wnt/β-catenin 通路蛋白表达，抑制大鼠心肌组织细胞凋亡，从而缓解大鼠心肌损伤严重程度。

有研究表明，AMPK 信号通路在心肌缺血再灌注损伤发生发展过程中发挥重要作用，激活AMPK信号通路能够减轻心肌组织细胞氧化应激损伤，抑制细胞凋亡，从而起到减轻再灌注损伤严重程度的作用[20，21]。本研究显示，心肌缺血再灌注损伤大鼠AMPK、PPARγ 表达较低，p38MAPK 表达较高，上调CTRP9 表达的心肌缺血再灌注损伤大鼠AMPK、PPARγ 表达上调，p38MAPK 表达下调，说明上调CTRP9 表达激活AMPK 信号通路，从而起到减轻心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌损伤、改善大鼠心功能的作用。

综上所述，上调心肌缺血再灌注损伤大鼠CTRP9表达，能够改善大鼠心室重构，减轻大鼠心肌组织氧化应激损伤、炎症反应，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能是调控Wnt/β-catenin 通路、AMPK/p38 MAPK/PPAR 通路蛋白表达，为心肌缺血再灌注损伤的临床治疗提供一定的参考依据。