Pim2/c-Myc 在弱精症生精细胞氧化应激中的表达及意义

游雪云，刘艳秋

（江西省妇幼保健院医学遗传中心 江西省出生缺陷防控重点实验室，江西 南昌 330006）

据报道，全球大约10~15%的夫妇患有不育不孕，而男性方面的因素大概占30~55%[1-2]。 有研究表明男性发生不育的原因较多且较繁杂， 如精索静脉曲张[3-5]、性激素分泌功能紊乱[6-7]、生精管道梗阻[8-9]、遗传因素[10-11]和营养不良等[12]，其最终引起精子质量的下降、 精子密度的减少甚至无精症是导致男性不育的最主要原因。 弱精症是一种危胁男性生殖健康的疾病， 同时也是困扰全球的一个医学难题。 生精细胞氧化应激是导致弱精症的一项重要原因，我们的前期研究发现Pim2/c-Myc 高表达于弱精症睾丸组织， 但其在生精细胞氧化应激中的作用尚未明确。 为了研究弱精症精子Pim2/c-Myc 蛋白与活性氧导致的氧化应激损伤关系，我们收集了弱精症患者和正常志愿者精液， 采用免疫印迹方法对精子Pim2/c-Myc 蛋白表达进行检测，并通过荧光探针检测精子ROS 含量，以阐明Pim2/c-Myc 蛋白与ROS 的关系及确认Pim2/c-Myc 蛋白的表达和弱精症间的相关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2020 年1 月至12 月我院（江西省妇幼保健院） 生殖医学中心进行精液常规检查标本进行研究。 弱精症患者共计76 例，弱精症患者的诊断标准为：A 级精子 （快速前向运动)<25%或A+B 级精子（前向运动的精子)<50%。其中，轻度弱精症组(n=42)A 级精子>10%，中度弱精症组(n=34)A 级精子<10%，其他精液常规参数正常。 正常对照组共50 例，正常对照组标准：（1）连续三次精液常规检查结果：PR≥32%； 同时PR+NP≥40%，精子的密度≥15×106/mL；（2）各项临床检测指标均在正常范围内；（3）各项性激素检测值均在正常范围内；（4）无先天性、损伤性生殖系统疾病。所有受试者标本均经江西省妇幼保健院伦理委员会批准， 受试者均被告知实验目并签署知情同意书。

1.2 试剂 Percoll 液（Pharmacia，美国），TRIzol 试剂（Invitrogen，美国），兔抗Pim2/c-Myc 单克隆抗体(美国Abcam 公司)；兔抗GAPDH 多克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)；HRP-羊抗兔多克隆抗体(美国Abcam 公司)；活性氧检测试剂盒(Takara) 。

1.3 仪器 HT-IVOSII 型（美国Hamilton Thorne 公司）全自动精子分析系统，Diff-Quik 精子快速染色试剂盒（深圳华康生物医学），高速冷冻离心机(德国beckman 公司)，Gallios 流式细胞仪(美国beckman 公司)。

1.4 标本采集 本研究受试者均在禁欲3～7 d 后，收集精液于消毒的广口无菌容器内，37 ℃恒温液化后，采用HT-IVOSII 型（美国Hamilton Thorne 公司） 全自动精液分析系统检查精子的常规参数及运动参数。 同时使用巴氏染色法，镜下检查精子形态和畸形率，并进行精子计数。随机选取正常人50例、轻度弱精症42 例及中度弱精症34 例样品，进行以下处理：向精液样本中缓慢加入PMSF(终浓度为0.2 mmol/L )，室温下10 000 r/min 离心10 min，底层沉淀即为精子, 上清为精浆；向精子沉淀中按洗涤缓冲液1∶1 比例缓慢加入洗涤缓冲液，室温下10 000 r/min 离心10 min，缓冲液洗涤2 次；向沉淀中加入150~200 μL 细胞裂解液，置低温超声细胞破碎10 次，每次5 s，低温孵育1 h，放置低温离心机，40 C，12 000 r/min 离心20 min，取离心上清液，即为精子总蛋白提取物，按150 μL/管将提取物冻存深低温冰箱（-800 C）中以备用。

1.5 采用Western blot 法检测精子Pim2/c-Myc 蛋白的表达 从低温冰箱（-80 ℃冰箱）中取出标本，按照标本蛋白浓度调整取样量，以GAPDH 蛋白做为内参，恒压电泳（电压设置为80v）1.5 h~2.0 h，蛋白浓缩胶扩散结束进入分离胶后调整电压为100 V，恒压电泳2 h；切取目的蛋白部分电泳胶，转移到PVDF 膜上； 室温脱脂奶粉封闭2 h； 以Pim2/c-Myc 抗体(兔源，用封闭液1∶500)和GAPDH 抗体为第一抗体，HRP-山羊抗兔IgG(1∶3000)为第二抗体，进行孵育；漂洗PVDF 膜，加入ECL 发光液，采用核酸蛋白分析仪进行分析，Pim2/c-Myc 与GAPDH蛋白的比值作为统计学分析样本表达量。

1.6 采用荧光探针测定精子ROS 根据实验分组，将三组（正常组、轻度弱精症和中度弱精症）精液分别取15 例样本，10 000 r/min 离心10~15 min，取离心沉淀物按缓冲液1：1 的比例洗涤； 室温下10 000 r/min 离心10~15 min，洗涤5 次，显微计数并观察细胞形态，调整细胞密度至1×106。 根据说明书操作步骤调整活性氧荧光探针DCFH-DA 浓度，使终浓度为10 μmol/L )，37 ℃避光孵育1 h。磷酸盐缓冲液洗涤标本3~5 次， 以使细胞的DCFHDA 充分除去。 荧光显微镜下观察并采用流式细胞仪对活性氧进行定量检测[13]。

1.7 统计学处理 结果采用SPSS 26.0 统计软件对相关数据结果进行统计学分析， 计量资料数据以（±s）表示，中度组、轻度组与正常对照组分别进行比较，采用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精液常规参数 正常组与弱精症组精液的常规检查结果，见表1。 结果显示，与正常对照组比较，弱精子症患者年龄、精液pH 值、精子的形态及精子密度等指标无明显差别(P>0.05)。然而，各弱精症组A 级精子百分比和A+B 级精子百分比与正常组相比有显著差异(P＜0.05)，且这些指标改变与弱精子症的严重程度相关(P＜0.01)，具有统计学意义。

表1 正常人与弱精症患者精液常规参数

2.2 Western blot 法检测Pim2/c-Myc 蛋白表达水平 Western blot 分析提示轻度弱精症组及中度弱精症组Pim2/c-Myc 蛋白的表达量均较正常对照组显著增多， 而且这些蛋白的表达量与弱精子症的严重程度呈正相关，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1—图2。

图1 弱精症Pim2/c-Myc 蛋白的表达

图2 Western Blot 检测Pim2/c-Myc 的定量结果

2.3 弱精症精子活性氧含量的增加 流式细胞术检测结果显示，同正常组比较，轻度及中度弱精症组精子活性氧含量明显增加， 差异有统计学意义(P＜0.05)，而且随着弱精症程度的加重，这种变化与Pim2/c-Myc 含量的变化是呈正相关的，见图3。

图3 流式细胞术对精子ROS 的定量结果

3 讨论

最近研究报道， 不育男性存在的共同特征—睾丸组织的氧化应激损伤， 它也许是导致男性不育的重要原因之一[14]。 氧化应激指的是当机体在受到各种有害刺激时， 体内高活性分子如ROS 产生过多，氧化物不能被彻底地清除，氧化和抗氧化系统出现失衡，导致组织器官的损伤。 精子活动力与ROS 具有明显相关性，ROS 是人体代谢产生的具有较强氧化能力的活性物质总称。 精子中产生的ROS 主要为O2-， 通过歧化反应生成过氧化氢(H2O2)， 其浓度对精子活动力的作用机制主要表现在两方面。 其一，在理化因素的刺激下，ROS 产生过量会破坏精子及精浆的抗氧化防御系统， 引起氧化应激反应，从而损伤精子的结构与功能，尤其会造成线粒体膜的损伤及精子DNA 损伤等[15]。 其二，生理水平的ROS 在激素的产生、精子获能、细胞信号转导、 顶体反应和精子运动能力等方面均发挥重要的作用。

c-myc 是一种常见的原癌基因， 有统计显示，在约20%的癌症人群中处于活化状态。 通过招募组蛋白乙酰酶、 一些转录因子和染色质调控蛋白等一系列途径也发现，c-myc 参与了从果蝇到人类等高等生物细胞基因组中15%基因的调控。 真核生物的细胞周期是由许多调控因子的结合与激活来调控的， 在细胞周期的发展中起到关键点作用的是G1 期的调控，c-myc 在多个水平上对该关键点进行调控。 研究显示，c-myc 在多种肿瘤中呈现高表达，如肺癌、前列腺癌，乳腺癌等，在低分化肿瘤中，c-myc 高表达尤为明显。pim 家族包括pim1，pim2 和pim3， 属于序列上具有很高同源性的钙调蛋白依赖性蛋白激酶。pim 蛋白激酶可通过增强致癌c-myc 和Ras 的活性而促进转化， 其在肿瘤发生过程中驱动显着的代谢变化。 有研究证明在缺乏pim 蛋白激酶，三重敲除（TKO）的所有三种同种型的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）不能耐受活化的K-Ras（K-RasG12V）的表达并经历细胞死亡。 将K-RasG12V 转导到这些细胞中显着增加了细胞活性氧（ROS）的水平。 有研究表明pim2 激酶在许多生理病理过程中通过调控信号转导发挥重要作用，包括细胞周期、细胞凋亡、细胞代谢、转录因子和蛋白质翻译等。特异地在人、 小鼠和大鼠的睾丸组织中高表达，与X 染色体的失活密切相关[16]。

我们的前期实验发现:pim2/c-myc 在男性弱精症睾丸组织中表达增高， 生精细胞内超氧化物歧化酶活性升高，而乳酸脱氢酶活性、丙二醛含量降低, 提示有诱导生精细胞氧化应激损伤的作用。 据此我们提出假说：pim2/c-myc 抑制Nrf2 表达过量ROS，精子中产生的ROS 主要为O2-，通过歧化反应可产生过氧化氢，导致睾丸生精细胞氧化应激。在前期实验研究的基础上，本研究增加样本量，进一步探讨pim2/c-myc 参与弱精症生精细胞氧化应激中的机制， 显示精子pim2/c-myc 蛋白的表达与弱精症有密切相关性， 免疫印迹实验表明弱精症患者特别是中度弱精症患者精子pim2/c-myc 蛋白表达明显升高。 为进一步研究弱精症pim2/c-myc蛋白和活性氧的相关性， 同免疫印迹相平行地运用ROS 荧光探针检测了精子ROS 的变化情况。 实验结果表明，与正常组对比，弱精症组精子ROS 含量明显升高，且升高与弱精症严重程度呈正相关。通过对精子pim2/c-myc 蛋白的表达量及ROS 水平的研究，验证了本实验的最初设想：弱精症患者精子pim2/c-myc 蛋白高表达伴随着活性氧含量的增加，导致氧化应激损伤及精子活力下降，可能是弱精症发病的分子机制之一。