Nrf2、MACC-1 在鼻咽癌组织中表达及其与临床病理学特征和预后的关系

康春凤，王志强，王江敏

（1.郑州市第九人民医院五官科；2.感染性疾病诊疗中心；3.重症监护室，河南 郑州 450000）

鼻咽癌发病早期无明显特异性， 临床确诊时患者已处于中晚期， 而放射治疗后的肿瘤细胞容易出现局部复发和远处转移等情况[1-2]。 癌症发生是多基因、多因素、多步骤的复杂过程，涉及细胞增殖、侵袭、分化等[3]。 探究鼻咽癌发生发展的作用机制，及早发现、准确诊断和及早治疗对治疗鼻咽癌患者至关重要。 结肠癌转移相关基因（Metastasis-associated in colon cancer-1，MACC-1） 已被证实是癌基因，在胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多种人类恶性肿瘤中发挥重要作用， 影响肿瘤的发生发展过程[4-6]。 既往研究显示，MACC-1 是肝细胞生长细胞激活配体的原癌基因， 可通过介导HGF/c-Met 信号通路影响肿瘤血管形成、 侵袭和转移[7]。核转录因子E2 相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2) 是机体内参与氧化应激反应的重要因子， 有研究显示，Nrf2 能通过抵抗氧化应激及细胞外有害物质对细胞的损害作用，进而抑制肿瘤癌变过程[8]。 本研究通过检测Nrf2、MACC-1 在鼻咽癌组织中表达分析其与临床病理学特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015 年1 月至2018 年1 月我院收治的60 例鼻咽癌患者作为观察对象，入组患者手术后进行癌组织病理检查， 将癌旁组织作为对照组。 鼻咽癌患者男性42 例，女性18 例，年龄35~65 岁，平均年龄（49.23±5.38）岁。 纳入标准：鼻咽癌诊断符合《2020 ESMO/EURACAN 临床实践指南:鼻咽癌的诊断,治疗和随访》[9]；鼻咽癌组患者均经病理检测证实；无临床资料史；患者临床资料完整。 排除标准：合并其他恶性肿瘤疾病；复发性鼻咽癌患者。 本研究获得本院医学伦理委员会的批准。

1.2 免疫组化链霉素－生物素过氧化物酶(S-P)法手术切取患者鼻咽癌组织标本以及对应的癌旁组织标本, 将鼻咽癌组织标本行福尔马林液脱水固定；石蜡包埋切片，采用SP 两步法进行免疫组化染色。具体步骤：切片在60 ℃烤箱内过夜后进行脱蜡水化，随后使用3%的过氧化氢室温孵育，蒸馏水冲洗，PBS 冲洗3 次，之后滴山羊血清封闭液，不洗， 直接滴加兔抗人MACC-1 或Nrf2 多克隆抗体，37 ℃孵育60~90 min，PBS 漂洗3 次，滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育，PBS 漂洗后滴加S-P 试剂，37 ℃孵育，PBS 漂洗后，DAB 显色， 苏木素复染，封片，镜检。 染色强度总评分为共3 分, 0 分为无着色，1 分为低度染色，3 分为 重度着色；阳性判定标准以细胞质、 细胞核着色即显示为棕色为阳性： 阳性细胞占比<5%为0 分；5%~25%为1 分；26%~50%为2 分；51%~75%为3 分；76%以上为4分。 两种积分之和≤1 分为 阴性， 大于1 分为阳性。 免疫组织化学试剂盒购于西宝生物科技(上海)股份有限公司；MACC-1 和Nrf2 抗体购于英国Abcam 公司；MACC-1 和Nrf2 抗体使用按照说明书进行操作。

1.3 观察指标 记录患者年龄、性别、病理分期、淋巴结转移、远处转移和组织学分化等临床病理特征。

1.4 随访 通过对入院记录的提取和随访获得患者临床资料。 通过门诊复查、电话、电子邮件等方式对患者进行随访工作。 随访起止时间为手术日，每3 个月随访一次，随访36 个月，随访终止时间为2021 年1 月。 随访终点为患者死亡、失访或随访结束。统计患者生存情况。生存期指从治疗结束至肿瘤复发或因任何原因导致死亡的时间。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析， 满足正态分布且方差齐的计量资料采用（±s）表示，采用两样本独立t 检验比较组间差异，计数资料用率表示，采用χ2检验。Kaplan Meier分析法绘制患者生存曲线； 比较采用Log-rank χ2检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌患者临床资料 60 例鼻咽癌患者，年龄>50 岁患者27 例（45.00%），年龄≤50 岁患者33例（55.00%）；男性患者42 例（70.00%）大于女性患者18 例 （30.00%）；T1~T2 患者27 例 （45.00%）；T3~T4 患者（中晚期）33 例（55.00%）；I~II 期患者24 例（40.00%），III~IV 期患者36 例（60.00%）；淋巴结转移患者40 例（66.67%），非淋巴结转移患者20 例 （33.33%）； 存 在 远 处 转 移 患 者39 例（65.00%），无远处转移患者21 例（35.00%）；分化型非角化性癌5 例（8.33%），未分化型非角化性癌55 例（91.67%）。

2.2 鼻咽癌组织和癌旁组织中Nrf2、MACC-1 表达情况 鼻咽癌组织中Nrf2 阳性表达率（48.33%）明显高于癌组织中阳性表达率(18.33%)，鼻咽癌组织中MACC-1 阳性表达率（63.33%）明显高于癌旁组织中MACC-1 阳性表达率（31.67%）（P<0.05）。 见表1。

表1 鼻咽癌组织和癌旁组织中Nrf2、MACC-1 表达情况比较（n=60，%）

2.3 Nrf2 表达与临床病理特征之间的关系 将Nrf2 表达与临床病理特征之间关系进行统计分析，结果显示，鼻咽癌患者病灶组织Nrf2 阳性表达与患者年龄、性别、病理分期、TNM 分期、淋巴结转移、远处转移以及组织学分化均无相关性，差异无统计学意义（P>0.05）。 见表2。

表2 鼻咽癌患者组织Nrf2 表达与临床病理特征之间的关系（n，%）

2.4 MACC-1 表达与鼻咽癌临床病理特征之间的关系 将MACC-1 表达与临床病理特征之间关系进行统计分析， 结果显示， 鼻咽癌患者病灶组织MACC-1 阳性表达与患者年龄、性别以及组织学分化无关，不具有统计学意义（P>0.05）。 T1~T2 期患者MACC-1 阳性表达率明显高于T3~T4 期患者，差 异 有 统 计 学 意 义 （P<0.05）。 III~IV 期 患 者MACC-1 阳性表达率明显高于I~II 期患者 （P<0.05）。 淋巴结转移患者MACC-1 阳性表达率明显高于非淋巴结转移患者（P<0.05）。 远处转移患者MACC-1 阳性表达率明显高于非远处转移患者（P<0.05）。 见表3。

表3 MACC-1 表达与鼻咽癌临床病理特征关系（n，%）

2.5 Nrf2、MACC-1 表达与患者预后关系 采用中位数法， 将患者分成阳性表达组和阴性表达组，Nrf2 阳性表达36 个月总生存率为63.64%，Nrf2 阴性表达总生存率为74.07%， 两组间生存率比较差异无统计学意义 （Log-rank χ2=0.748；P=0.387）；MACC-1 阳性表达总生存率为50.00%，MACC-1阴性总生存率为77.27%， 两组间生存率比较差异有统计学意义（Log-rank χ2=4.318；P=0.038）。见图1。

图1 Nrf2、MACC-1 表达与患者预后关系

3 讨论

鼻咽癌是具有高患病率和高致死率的人类恶性肿瘤。 流行病学调查研究显示，全球每年鼻咽癌发病病例多达10 万例，死亡病例约有60 万例，而早期鼻咽癌患者通过放射治疗和化学治疗的综合治疗,其预后通常较好，五年生存率可以达到90%以上[10-11]。 因此，早发现和寻找潜在的有效生物标志物对临床早期筛查、诊断有重要指导意义。

本研究发现60 例鼻咽癌患者，年龄>50 岁患者27 例（45.00%），年龄≤50 岁患者33 例（55.00%）；男性患者42 例 （70.00%） 大于女性患者18 例（30.00%）；T1~T2 患者27 例（45.00%）；T3~T4 患者（中 晚 期）33 例 （55.00%）；I~II 期 患 者24 例（40.00%），III~IV 期患者36 例（60.00%）；淋巴结转移患者40 例（66.67%），非淋巴结转移患者20 例（33.33%）；存在远处转移患者39 例（65.00%），无远处转移患者21 例（35.00%）；分化型非角化性癌5 例（8.33%），未分化型非角化性癌55 例（91.67%），说明鼻咽癌患者多存在淋巴结转移和远处转移，多见于未分化型非角化性癌。 进一步分析发现，在鼻咽癌组织中Nrf2 阳性表达率（48.33%）明显高于癌组织中阳性表达率 (18.33%)， 鼻咽癌组织中MACC-1 阳性表达率（63.33%）明显高于癌旁组织中MACC-1 阳性表达率 （31.67%）， 说明Nrf2 和MACC-1 可能参与鼻咽癌恶性发展过程。 Nrf2 是一种高度保守的关键性核转录因子， 对细胞内氧化还原状态非常敏感， 并发挥着保护细胞内环境稳定的作用[12]。 既往研究结果显示，Nrf2 在喉鳞状细胞癌中表达上调，且与淋巴结转移、TNM 分期以及病理分期有关[13]。MACC-1 最初被发现在结肠癌患者中异常表达， 参与结肠癌细胞多种生理病理等生物学行为，比如增殖、迁移、侵袭等过程[14]。 近年来多项研究报道MACC-1 在宫颈癌、肝癌、乳腺癌、 胃癌等多种肿瘤组织中存在异常表达， 调节MACC-1 表达可影响肿瘤细胞的生长、迁移、转移等能力[15-16]。 本研究结果表明，MACC-1 在鼻咽癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织中表达，这与前人研究结果基本一致。

将Nrf2、MACC-1 表达与临床病理特征之间关系进行统计学分析，结果显示，鼻咽癌患者病灶组织Nrf2 阳性表达与患者年龄、性别、病理分期、TNM 分期、淋巴结转移、远处转移以及组织学分化均不具有相关性； 鼻咽癌患者病灶组织MACC-1阳性表达与患者年龄、性别以及组织学分化无关，而与患者病理分期、TNM 分期以及淋巴结转移有关。 有研究显示，Nrf2 阳性表达与肺腺癌患者年龄、 分化程度以及病理亚型之间不具有相关性[17]，这与本文研究结果部分类似。 有研究显示，Nrf2 表达与食管鳞癌组织中病变长度、浸润深度、淋巴结转移存在显著相关性[18]。这与本文研究结果存在差异，因此，我们推测Nrf2 表达水平在不同类型的恶性肿瘤中表达存在差异性， 但本文纳入样本量及肿瘤类型均有限， 需要进一步扩大样本量和纳入范围进行证实。此外，两组患者Nrf2 阳性表达总生存率无明显差异， 而患者MACC-1 阳性总生存率具有明显差异； 提示MACC-1 差异表达可作为预测鼻咽癌患者预后的重要指标。

综上所述，Nrf2 表达与临床病理特征无明显关系，MACC-1 阳性表达与患者病理特征存在关联性， 且与患者预后不良有关。 本文仅初步探讨了Nrf2、MACC-1 表达与鼻咽癌病理特征之间的关联，但其具体的作用机制有待进一步研究。