基于生物信息学方法对EV71 感染miRNA生物标志物筛选及鉴定

单志鸣，杨俊梅，孙红启，李铁威，成怡冰

（郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院 郑州市儿童感染与免疫重点实验室，河南 郑州 450000）

手足口病 (Hand, foot and mouth disease,HFMD)是一种由肠道病毒感染引起的儿童常见感染性疾病，多累及2~5 岁儿童，手足口病主要的病原为肠道病毒柯萨奇病毒A 组16 型(CA16) 和肠道病毒71 型(EV71)等,典型临床表现为口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹, 此外，EV71常引起严重中枢神经系统并发症, 如脑膜炎、脑炎、急性迟缓性瘫痪等[1-2]。 微小脱氧核糖核酸（microRNA）是一种19~22 个碱基的小分子RNA，大量研究表明其参与调控细胞增殖、分化、病毒感染等多种生物学过程[3]，为了进一步探讨其在EV71感染过程中的功能,本研究我们通过分析基因综合表达数据库（GEO）[4]中EV71 感染后差异表达microRNAs，分析这些差异表达基因所参与的生物学过程，以及在EV71 感染过程中发挥关键作用的通路途径，更好的揭示EV71 感染人体的更多分子机制，为后续研究提供理论基础，并为临床诊断和治疗提供有诊断和预后价值的标志物以及治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 数据来源 在美国国家生物技术信息中心(NCBI) 的公共数据库GEO 中以“EV71”“microRNA”检索,对检索结果按照如下标准筛选：（1）至少3 个生物学重复；（2）研究设计有对照组。筛选后得到microRNA 芯片数据集GSE57372，其包含EV71感染人结直肠癌细胞HT29 组和对照组共6 个样本， 芯片分析平台为Affymetrix 多物种miRNA-2芯片。

1.2 筛选差异表达基因 用在线分析工具GEO2R对miRNA 矩阵作差异表达分析， 设置筛选标准为： 感染组与对照组相比差异倍数2 倍以上，P 值小于0.05（Log FC>1, P<0.05）。

1.3 差异miRNA 聚类分析 对符合筛选标准的差异miRNA 在TAM2.0 网 站（http://www.lirmed.com/tam2）[5]作功能聚类分析， 该网站可以对上传的miRNA 列表作生物学功能和相关疾病聚类富集分析。

1.4 差异表达miRNA 关键靶基因筛选和互作关系图构建 对得到的差异表达的miRNA 按照上调和下调分别在mirTarBase v6.0（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）[6]作靶基因预测，将靶基因列表在STRING 在线分析网站(http:// www.stringdb.org)[7]分别作蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）构建， 通过构建PPI 网络分析靶基因的蛋白互作关系，筛选条件为：互作得分＞0.4，将结果文件导入Cytoscape 软件[8]，用Cytohubba 插件分别筛选MCC 等级排名前10 的关键基因； 接下来在Cytoscape 中构建差异miRNA 和关键基因的互作关系图。

1.5 差异miRNA 表达水平验证 下载数据集GSE45816 结果文件， 将差异miRNA 的表达水平导入GraphPad Prism 8.3, 对感染组和对照组表达水平以柱状图显示。

2 结果

2.1 感染组与对照组差异基因 用GEO2R 分析得到106 个差异表达miRNA，78 个表达上调，28 个表达下调，以Log FC>1，P<0.05 为条件筛选，并将探针对照平台注释文件后得到人源miRNA 分子11 个，其中7 个上调，4 个下调，见表1。

2.2 差异miRNA 聚类分析 生物功能聚类结果显示差异miRNA 主要富集在胶原形成、细胞外基质重构、细胞黏附、固有免疫、神经元凋亡、细胞死亡等功能过程，疾病聚类主要有慢性乙肝、流感、腺病毒感染等感染性疾病以及肺源性高血压、 大脑缺血等心血管疾病， 还有克罗恩病和获得型免疫缺陷等免疫系统相关疾病，见表2。

表2 miRNA 生物学功能和相关疾病聚类富集分析结果

2.3 miRNA 靶基因富集分析和关键靶基因-miRNA 互作关系图 通过靶基因预测，7 个上调miRNA 靶基因380 个，4 个下调miRNA 靶基因210个，将靶基因构建PPI 互作网络及富集分析（通路的富集分析），见表3。 结果文件导入Cytoscape 软件， 用Cytohubba 插件分别筛选MCC 等级排名前10 的关键基因，见表4；差异miRNA 和关键基因的互作关系显示miR-29b-3p、miR-455-5p、miR-30c-1-3p、miR-149-3p、miR-483-5p、miR-320c、miR-2861 等7 个miRNA 起核心作用 （菱形为上调，三角形为下调，椭圆形为靶基因）见图1—图2。

图1 上调miRNA 与靶基因调控关系图

图2 下调miRNA 与靶基因调控关系图

表3 靶基因通路的富集分析结果

表4 MCC 等级排名前10 的关键基因

2.4 差异miRNA 表达水平验证 GSE45816 为EV71 感染人神经母细胞瘤的miRNA 表达数据，将差异列表的miRNA 在其中的表达量导入GraphPad,柱状图结果显示，所有miRNA 的表达水平在感染组和对照组均没有统计学意义（P>0.05）,但是与对照组相比，miR-320c 和miR-149-3p 的表达水平升高，miR-29b-3p 和miR-30c-1-3p 表达水平降低，见图3。

图3 差异miRNA 在GSE45816 中表达水平

3 讨论

手足口病作为儿童感染性疾病， EV71 是引起手足口病最常见的致病病毒之一， 常引起重症手足口患儿发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等严重并发症， 严重威胁着儿童的身体健康[9]。 miRNA 作为一种非编码RNA,可以参与基因调控的多个环节， 最普遍的功能为通过剪辑互补配对的方式靶向结合基因的3’ 端的非翻译区，依赖一些结合蛋白形成复合物调节靶基因， 可促使靶基因降解而不能发挥功能，此外，一些临床相关性研究也发现miRNA 对于疾病的诊断和治疗也具有潜在的重要意义[3]。 随着高通量测序技术的发展， 依托其研究疾病发生发展过程中的基因表达分析越来越成熟， 在探索疾病的相关分子机制和诊断方面发挥了重要作用, 伴随对疾病研究的深入， 将对筛选疾病的诊断标志物和治疗靶点提供依据。

本研究通过分析EV71 感染和正常组的差异表达miRNA, 得到106 个差异表达miRNA，78 个表达上调，28 个表达下调，以差异2 倍以上和P 值小于0.05 为筛选条件， 并将探针对照平台注释文件后进一步综合分析得到人源miRNA 分子11个，其中7 个上调，4 个下调，为了研究这些分子可能参与EV71 感染调控的生物学过程， 对差异的miRNA 在TAM2.0 网站作生物学功能和相关疾病聚类富集分析， 结果显示这些差异表达的miRNA生物功能聚类主要富集在胶原形成、 细胞外基质重构、细胞黏附、固有免疫、神经元凋亡、细胞死亡等， 疾病聚类主要有流感等病毒感染性疾病以及肺源性高血压、 大脑缺血等心血管疾病，EV71 病毒感染后患者机体免疫系统激活， 进入体内的病毒被模式识别受体识别， 启动机体固有免疫发挥作用清除病毒DNA， 病毒的一些蛋白也会通过影响体内的一些蛋白发挥效应功能， 进而调节炎症因子的分泌，因此免疫系统在EV71 病毒和宿主的相互对抗过程具有重要的调节作用[9]；EV71 感染后，常常会引起重症患儿的神经源性肺水肿，造成患者缺血缺氧加重病情，与富集分析结果相符合，miRNA 主要通过调节下游靶基因来发挥功能，通过对靶基因的富集分析发现， 靶基因富集通路有缺氧诱导因子1 信号通路、 凋亡和氧化应激诱导细胞凋亡等靶基因通路富集， 同样也验证了上述结果，因此，这些差异miRNA 可能主要通过参与调控缺氧诱导因子通路、 凋亡和氧化应激参与EV71 感染发生发展过程。

缺氧诱导因子-1 普遍存在于人和哺乳动物细胞内， 正常情况下有表达很快会被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解， 缺氧时才会稳定表达，可以作为感染性疾病的药物治疗靶点[10]。 研究显示干扰HIF-1α 基因表达后，通过信号传递减少了血管内皮生长因子合成， 表明其参与血管新生和组织细胞增殖分化的生物过程[11]，还可以增强甲型流感病毒和人类缺陷病毒的复制，增加2 型肺泡上皮细胞的自噬，促进血管外基炎症的发生[12-13]。EV71 感染后通过激活整合素及血管生长因子调节促炎因子分泌， 还会损伤线粒体而导致活性氧累积，持续的活性氧增加可以损伤线粒体，过度累积直接或者间接激活NF/KB 和p38 等信号通路，增加下游的多个促炎因子生成[14]，活性氧的增加除了促进白介素1B 和白介素6 等促炎因子分泌外，还可促使细胞发生凋亡[15]，EV71 3C 蛋白可裂解RNP 结合蛋白A1，从而破坏其与下游干扰素诱导基因的结合激活细胞凋亡[16]，另一研究通过转录组分析发现EV71 病毒的2A 蛋白在调节细胞凋亡的过程中起到了驱动作用[17]。富集分析结果表明差异miRNA 在EV71 感染的过程中主要通过调节HIF-1α、 细胞凋亡和氧化应激等信号通路参与感染的发生和进展过程， 进一步我们分别将上调和下调miRNA 分子的靶基因构建蛋白互作网络， 使用Cytoscape 的Cytohubba 插件筛选MCC 等级排名前十的靶基因，根据靶基因与miRNA 调节关系构建了互作关系图， 表明miR-29b-3p 和miR-320c 等7 个miRNA 可能发挥关键的调节作用， 外部验证结果显示虽然感染前后表达差异水平没有统计学意义， 但与对照组相比，miR-320c 和miR-149-3p的表达水平是升高的，miR-29b-3p 和miR-30c-1-3p 表达水平是降低，进一步证明这4 个miRNA可能发挥关键调控作用，之前的研究[18]发现在CA16 感染后miR-149-3p 可能通过下调表达而减少对靶基因的抑制导致感染后的一些病理过程，与本研究的结果不一致， 有待深入研究，miR-320c、miR-29b-3p 和miR-30c-1-3p 与手足口病的关系为首次报道， 我们的结果表明它们可能通过调节感染过程中的细胞凋亡和促炎反应介导宿主与EV71 病毒作用，具体的分子机制有待本课题进一步研究。

综上， 通过分析EV71 感染与否得到的差异miRNA 分子，显示其主要通过HIF-1α、细胞凋亡和氧化应激等信号通路调节感染发生和进展过程，miR-320c、miR-149-3p、 miR-29b-3p、miR-30c-1-3p 在其中发挥关键作用， 可为未来本课题研究详细分子机制提供了基础。