精子-宫颈黏液穿透功能与精液常规分析参数和精子DNA碎片指数的相关性分析*

邓顺美，蒋敏，庞韬，刘晓华，唐雨倩，李月华，朱胜辉，赵丽芳，张欣宗（1.国家卫生健康委员会男性生殖与遗传重点实验室，广州 510600；.广东省生殖科学研究所男科，广州 510600）

影响精子-宫颈黏液穿透功能的因素，一个来自宫颈黏液，另一个来自精子本身。精子-宫颈黏液相互作用体内试验（性交后试验）目的在于测定宫颈黏液中的活动精子数，评估性交几小时后精子存活情况和精子状态［1］。精子-宫颈黏液相互作用体外试验（毛细管试验）既可以单纯评价精子的宫颈黏液穿透功能，又可以评价影响精子穿透的宫颈黏液因素。宫颈黏液是影响精子-宫颈黏液穿透功能的重要因素，在宫颈黏液正常的情况下，精子本身的因素就尤为重要。精子本身有哪些因素对精子的穿透功能有影响，尚不明确。本研究从精液常规参数、精子形态和精子DNA碎片指数等多个角度来探讨影响精子-宫颈黏液穿透功能的精子因素。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020 年2 月至2021 年3 月于广东省生殖科学研究所门诊进行生育力评估的130名男性，年龄24～45岁，根据精子-宫颈黏液穿透试验结果差、中、好，将其分别纳入A 组、B 组和C组。纳入对象身体健康，有明显的男性体征，否认腮腺炎、睾丸炎、附睾炎病史和睾丸外伤史，无性功能障碍，近1 年内无不良生活嗜好（吸烟、酗酒、吸毒等），无家族性遗传性疾病史，睾丸、附睾、输精管等检查均无异常。2 次精液分析结果为无精子症或重度少精子症的患者排除在外。正常宫颈黏液来源于本院生殖中心拟行供精人工授精且排卵监测正常的已婚育龄妇女。本研究已获得相关医学伦理委员会批准［批准文号：伦审研第〔2016〕（16）号］，所有参与研究者均知情同意。

1.2 仪器与试剂 计算机辅助精子分析系统（CASA）（广州友宁生物科技公司）；全自动染色机（武汉俊杰电子公司）；巴氏染色液（珠海贝索生物技术公司）；精子DNA 碎片检测试剂盒（深圳华康生物医学工程公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 研究对象禁欲2 ～7 d，采用手淫法取精液，用广口无毒容器收集精液标本，置于37 ℃恒温水浴箱中等待液化。正常宫颈黏液标本：选取月经中期接近排卵期前的正常已婚育龄妇女为宫颈黏液获取对象，用阴道窥器暴露宫颈，以绵拭子轻轻擦拭宫颈外口以除去积存的阴道污染物。然后用棉拭子清除宫颈外的黏液。采用不带针头的结核菌素注射器深入宫颈管内大约1 cm处抽吸宫颈黏液。然后，按宫颈黏液体积、黏稠度、羊齿状结晶、成丝性和细胞性进行评分。评分在12 ～15分且pH为7.0～8.5的宫颈黏液用于精子-宫颈黏液穿透实验。

1.3.2 精液常规分析 精液完全液化后，常规检测精液黏稠度、有无精子凝集、精液量、pH值，制备精液湿片以判定精液常规分析是否需要稀释，以及稀释倍数。无需稀释的精液充分混匀，吸取精液标本直接上样；需要稀释的精液标本，按相应的稀释倍数制备精液标本，再取稀释标本上样。精子浓度、前向运动精子百分率采用20 μm深的精子计数池进行检测，吸取2 μL混匀的精液标本或混匀的稀释标本充满计数池，利用CASA进行计算机辅助分析。

1.3.3 精子形态分析 吸取完全液化后的精液标本5 μL置于载玻片的一端，应用拉薄技术制作精子涂片，并进行固定。采用全自动染色机进行巴氏染色。按照WHO推荐的评判标准对精子形态进行判读。

1.3.4 精子-宫颈黏液穿透实验 精子-宫颈黏液穿透实验采用WHO《人类精液与精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》第3 版推荐的方法实施。运用毛细管吸取正常宫颈黏液至7 cm 处，吸取宫颈黏液的一端用黏土封住，将开口端放入装有100 μL液化精液的自制储池，整个毛细管呈45°放置湿盒中，1 h后取出观察评估。根据毛细管1 cm、4 cm、7 cm处低倍镜观察到的精子总数和最前面精子的游动距离进行评分，0 分为阴性，1 ～8 分为差，9～11分一般，12分以上为好。

1.3.5 精子DNA 碎片指数检测 用精子核DNA荧光染色试剂盒进行精子DNA碎片检测分析。双链DNA结合吖啶橙荧光染料后精子在荧光显微镜下呈现绿色荧光，单链DNA 结合荧光染料后精子显示红色荧光。每份精液标本染色后，在荧光显微镜下记数至少200个精子，计算红色荧光精子所占的百分率，该百分率即为精子DNA碎片指数。

1.4 统计学分析 采用SPSS 24.0 软件对A、B、C组实验数据进行单因素方差分析，组间两两分析采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

130 例男性精液标本精子-宫颈黏液穿透实验中，20例（A组）穿透结果为差，58例（B组）结果为中，52 例（C 组）结果为好。A、B 和C 组精液指标检测数据见表1，单因素方差分析提示，精液pH值、精液量在3 组之间差异无统计学意义（P ＞0.05），精子浓度、前向运动精子百分率、总精子数、正常形态精子百分率、精子DNA 碎片指数在3 组之间呈现显著性差异（P＜0.05）。

表1 精子-宫颈黏液穿透功能A、B、C组精液参数结果（±s，n＝130）

表1 精子-宫颈黏液穿透功能A、B、C组精液参数结果（±s，n＝130）

分组 pH值 精液量（mL） 精子浓度（×106／mL）前向运动精子百分率（%） 精子总数（×106）正常形态精子百分率（%）DNA碎片指数（%）A组（n ＝20） 8.06±0.05 3.47±0.38 40.77±10.73 10.66±1.57 129.11±26.91 2.99±0.73 21.33±2.93 B组（n＝58） 8.03±0.03 3.62±0.19 78.1±8.85 30.17±1.49 265.34±28.89 7.77±0.74 11.19±1.05 C组（n＝52） 8.15±0.03 3.48±0.21 122.27±12.25 41.82±1.66 370.70±31.46 9.08±0.81 9.49±0.98 F（P）值 0.145（＞0.05） 0.135（＞0.05） 10.04（＜0.05） 58.12（＜0.05） 9.99（＜0.05） 9.18（＜0.05） 14.21（＜0.05）

A、B和C组精液指标检测结果两两比较显示，精液pH 值、精液量在3 组间差异无统计学意义（P＞0.05）；精子浓度、前向运动精子百分率和精子总数在A、B和C任意2组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常形态精子百分率、精子DNA碎片指数在3组之间只有A组与B组、A组与C组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

精子-宫颈黏液穿透试验是体内试验（性交后试验）的模拟试验，是评价精子功能的重要试验之一，只有穿过宫颈黏液的精子才有最终受精的机会。影响精子-宫颈黏液穿透功能的因素有来自宫颈黏液的因素，也有来自精液本身的因素。在体内，宫颈管壁由黏膜和肌层组成，宫颈黏膜内褶形成隐窝，宫颈管黏膜和隐窝上皮柱形分泌细胞分泌黏液，促进精子经宫颈管进入子宫，纤毛细胞借纤毛运动向下排除宫颈黏液，经宫颈外口进入阴道。宫颈黏液在宫颈管内的结构随甾体激素的变化而发生周期性变化，以适应精子穿过宫颈黏液进入子宫的需要。通常情况下，月经中期接近排卵期的宫颈黏液更利于精子穿透［2］。此时女性的雌激素水平高，宫颈黏液黏稠度最小。排卵后，宫颈黏液性质发生显著改变，精子的穿透能力开始减弱。除了宫颈黏液因素之外，精液本身的质量也影响精子的宫颈黏液穿透功能。已知的抗精子抗体、前向运动精子百分率是影响精子-宫颈黏液穿透功能的重要因素。在本实验中，以精子-宫颈黏液穿透功能的不同级别进行分组，来研究具有不同精液参数的精液对精子-宫颈黏液穿透功能的影响。从统计实验结果来看，精液量和pH 值对精子-宫颈黏液穿透功能无显著影响，而精子浓度、前向运动精子百分率、总精子数、正常形态精子百分率及精子DNA碎片指数对精子-宫颈黏液穿透功能具有显著影响。精子浓度、前向运动精子百分率、总精子数、正常形态精子百分率数值越高，精子穿透功能越好。精子DNA碎片指数越低，精子穿透功能越好；碎片指数越高，精子穿透功能越差。

精子-宫颈黏液穿透功能是男性不育症检查的重要组成部分，精子穿透功能异常也是采用人工授精或其他辅助生殖技术的参考指征。精子-宫颈黏液穿透试验通常在性交后试验为阴性结果后才进行，其优点在于可使用供者精液和供者宫颈黏液作为对照，进行交叉试验来鉴定阴性结果原因是来自女方、还是男方，或是男女双方，也可用于评估男性或女性配偶抗精子抗体试验阳性的意义［1］。精子-宫颈黏液穿透试验也存在一定的局限性，正常的宫颈黏液标本在一般的男科实验室难以获取，因此，试验的开展受到一定的限制。本试验撇开宫颈黏液因素，即在宫颈黏液正常情况下，精子浓度、前向运动精子百分率、总精子数、正常形态精子百分率是影响精子-宫颈黏液穿透功能的关键因素，这些精液参数的值越高，精子-宫颈黏液穿透功能越好。另外，精子DNA碎片指数对精子-宫颈黏液穿透功能也有重要影响，精子DNA 碎片指数高的精液标本穿透功能也很差。已有研究提示，精子DNA 碎片指数往往与精子质量密切相关，它与精液密度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率呈负相关，对IVF 的受精率、早期流产率和分娩率有显著影响［3-6］。在自然条件下，反复流产夫妻中男性精子DNA碎片指数高于正常人群。在辅助生殖技术过程中，高DNA碎片指数不仅影响正常受精率、优质胚胎率，对临床妊娠率也有很大的影响，流产率随之增加［7-9］。精子DNA碎片指数增高，其形成的囊胚染色体异常的概率也会增加。另一方面，在精液常规分析参数异常的男性和部分精液参数正常的不育男性中普遍存在精子DNA 损伤［10］。本实验结果显示精子-宫颈黏液穿透功能好的精液标本，其精子DNA碎片指数相对较低。反之，其精子DNA碎片指数则相对较高。不难看出，宫颈黏液具有重要的筛选功能，精子DNA 碎片指数较高的精液标本，只有少部分质量较好的精子才能穿透宫颈黏液。因此，通过宫颈黏液筛选过的精子更有利于精子受精和提高优质胚胎率。

综上所述，精子-宫颈黏液穿透功能与精子浓度、精子活力、总精子数、正常形态精子百分率和精子DNA碎片指数等多种因素密切相关。精子浓度、精子活力、总精子数、正常形态精子百分率越高，精子DNA碎片指数越低，其精子-宫颈黏液穿透功能越好，反之，则精子-宫颈黏液穿透功能越差。精子-宫颈黏液穿透功能检测结合精液常规、精子形态和精子DNA碎片指数分析能更客观全面地评估男性精液质量，为男性不育症诊断治疗提供参考依据和决策指导。