全自动凝血分析仪检测2种诱导剂诱导的血小板聚集试验参考区间的建立

寿玮龄，陈倩，徐雯，马超超，吴卫（.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科，北京 00730；.新乡医学院第三附属医院检验科，河南 新乡 453000）

血小板聚集试验（platelet aggregation test， PAgT）是评估机体血小板功能、监测抗血小板治疗效果等的重要指标。PAgT 光学法（light transmission aggregometry，LTA）的检测原理为通过在富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）中加入不同种类、不同浓度诱导剂，使血小板聚集，导致PRP 浊度变化，透光率增加，检测系统将浊度变化转变为电信号，连续记录血小板聚集曲线，从而得到血小板最大聚集率（maximum platelet aggregation rate，MPAR）等参数。LTA 与临床事件相关性较好，临床应用广泛，被称为血小板聚集功能检测的“金标准”［1-2］。二 磷酸 腺 苷（adenonisine disphosphate，ADP）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是常用的2种诱导剂。根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）H58-A指南、国际血栓与止血学会（International Society on Thrombosis and Haemostasis，ISTH）共识等推荐，ADP 诱导剂常用终浓度为2、5和10 μmol／L，AA诱导剂常用终浓度为0.5 和1.0 mmol／L［3-6］。Sysmex公司CN系列和CS系列全自动凝血分析仪进行LTA，可减少手工加样误差，同时可使用多种诱导剂，检测用量少，一定程度上可减少患者采血负担。目前国内外尚无CN3000 及CS5100 全自动凝血分析仪的PAgT参考区间的报道。本研究按照CLSI EP28-A3c 文件要求［7］，通过募集表观健康成年人，采用CN3000 和CS5100 全自动凝血分析仪进行不同终浓度ADP、AA 诱导的PAgT，用非参数法（non-parametric method）建立上述诱导剂诱导PAgT的MPAR值的表观健康人群参考区间。

1 对象与方法

1.1 研究对象 自2021年5月至12月，募集年龄18～70 岁表观健康人共134 例，按照18 ～30 岁、31～40岁、41～50岁、＞50 岁分为4 个年龄段，男女比例分布均匀。入选标准：（1）体质指数（BMI）在参考区间18.0 ～28.0 kg／m2内；（2）女性未处于妊娠期及哺乳期（1年内）；（3）无皮肤黏膜出血史及相关家族史；（4）未服用抗血小板药物及其他导致血小板功能异常的药物，包括吲哚美辛、酚妥拉明、双嘧达莫、青霉素类药物、肝素等；（5）近3 个月内未服用中药制剂；（6）无主要器官系统严重疾病，3个月内体检结果提示肝肾功能正常；（7）近2 周内无发热感冒等症状，近3个月未献血；（8）吸烟量每日不超过5支；（9）每日饮酒量小于100 mL；（10）近1个月内作息正常。

通过调查问卷了解研究对象姓名、年龄、BMI、饮食、医疗记录等基本信息；签署知情同意书后入组。排除标准：（1）入组至标本采集前不满足上述表观健康入选标准；（2）采血前24 h 摄入咖啡因，吸烟、饮酒及参加剧烈运动；（3）自愿退出；（4）标本采集处理后不满足LTA检测要求。

本研究已通过中国医学科学院北京协和医院伦理委员会批准（伦理审查批件编号：HS-2459）。

1.2 仪器与试剂 CN3000 全自动凝血分析仪、CS5100全自动凝血分析仪、XS-800i 全自动血细胞分析仪及配套血小板聚集功能ADP 检测试剂盒（批号：F1903231）、AA检测试剂盒（批号：FA0578）由日本Sysmex公司提供。试剂配制及分装、保存按照试剂说明书要求进行，ADP 终浓度分别为2、5和10 μmol／L，AA终浓度分别为0.5和1.0 mmol／L。

1.3 标本采集与处理 清晨采集研究对象空腹静脉血，0.109 mol／L 枸橼酸钠与静脉血按1 ∶9 比例混匀。采集标本时在针插入血管见回血后应立即释放止血带；采血过程不超过1 min。标本采集后室温静置30 min，以200×g离心10 min获得PRP，后将剩余标本以1 500×g 离心10 min 获取乏血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）。离心后标本无黄疸、乳糜及溶血。

1.4 标本检测 计数PRP 中血小板数，剔除PRP血小板计数小于150×109／L的标本，PRP 血小板计数增高时不进行调整。20 μL 0.9%NaCl 溶液添加到140 μL PPP 中，660 nm波长下设置为透光强度基线；20 μL 诱导剂添加到140 μL PRP 中，测定660 nm波长下透光度的变化，计算MPAR。标本采集后4 h内完成检测。

1.5 重复性 检测10 个不同终浓度诱导剂诱导的MPAR，各取正常水平临床标本1 人份，每份标本重复检测11次，计算后10次检测结果的算术平均值、标准差和变异系数（CV）。

1.6 统计学分析 采用Excel、JMP Trail 16、SPSS 21.0软件和R语言4.0.5（reference intervals 1.2.0版本）进行数据分析。按照CLSI EP28-A3c 文件，首先进行数据正态性分布检验，对非正态分布数据进行“Box-Cox”正态转换后，使用Turkey 法对数据进行离群值剔除（低限，Q1-1.5×IQR；高限，Q3+1.5×IQR：IQR ＝Q3-Q1）。独立样本多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验，两组之间的比较用Mann-Whitney U检验；配对样本间比较采用Wilcoxon 符号秩检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。按非参数方法计算参考区间，取数据分布的第2.5 百分位数和第97.5百分位数作为参考下限（lower reference limit，LL）和参考上限（upper reference limit，UL），并计算90%置信区间（confidence intervals，CI）。

2 结果

2.1 重复性 不同终浓度ADP 和AA诱导的MPAR的不精密度，以CV表示，均小于5.00%。见表1。

表1 不同终浓度ADP 和AA诱导的MPAR重复性

2.2 表观健康人ADP 和AA诱导的MPAR生物参考区间建立

2.2.1 数据分布 134 例入选者中男性69 例，女性65例，18 ～30 岁30 例，31 ～40 岁32 例，41 ～50岁36 例，＞50 岁36 例；男女比例在各年龄段均匀分布。CN3000 和CS5100 系统上AA 终浓度0.5 mmol／L诱导的MPAR 分别剔除离群值3 个和4个，其他终浓度诱导剂诱导的MPAR各剔除离群值1个。PRP 血小板计数为（306.9±71.8）×109／L，所有PRP 血小板计数均大于150×109／L。

2.2.2 不同性别及年龄段间MPAR 比较 根据非参数秩和检验结果提示，2 个检测系统检测不同终浓度ADP、AA诱导的MPAR 在男女之间差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表2。2个检测系统检测不同终浓度ADP、AA诱导的MPAR在4 个年龄段间差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表3。

表2 不同性别间ADP 和AA诱导的MPAR（%）

表3 不同年龄段间ADP 和AA诱导的MPAR（%）

2.2.3 同系统不同终浓度诱导剂间MPAR 及不同检测系统间MPAR比较 2 个检测系统ADP 终浓度2、5 μmol／L（CN 系列Z ＝-2.634，P ＝0.001；CS系列Z ＝-4.996，P ＝0.000），CS 系列AA 终浓度0.5、1.0 mmol／L（Z ＝-3.361，P ＝0.008）之间MPAR差异有统计学意义。根据Wilcoxon 符号秩检验分析，除外AA 终浓度1.0 mmol／L（Z ＝-2.319，P ＝0.020），其他不同种类不同终浓度诱导剂诱导的MPAR在CN3000和CS5100 两系统间差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2.4 ADP 和AA 诱导的MPAR 参考区间建立 取数据分布第2.5 百分位数和第97.5 百分位数作为LL和UL，表观健康人不同终浓度ADP、AA诱导的MPAR参考区间及90%CI结果见表4。

表4 表观健康人ADP、AA诱导的MPAR的参考区间

3 讨论

本研究中2 个检测系统不同终浓度ADP 和AA诱导的MPAR 重复性分别为2.87%～4.92%和2.03%～4.46%，与文献报道［8］基本一致，远低于试剂说明书正常标本最大聚集率的CV%≤20%的标准，满足临床检测需求。

与Platton 等［9］纳入42 例表观健康人在Sysmex CS2X00系统上采用第2.5和第97.5百分位数的结果相比较，本研究ADP 终浓度2 μmol／L 参考区间与其接近，但文献中ADP 终浓度5 μmol／L 和10 μmol／L 时生物参考区间分别是44%～98%和48%～106%，与本研究结果存在差异，本研究中AA 2个终浓度生物参考区间结果与该文献相比也存在差异；但本研究中AA 终浓度1.0 mmol／L 则与Stratmann等［10］在CS2100 系统上结果接近。王佳等［11］建立的ADP 终浓度2 μmol／L 手工法参考区间为（60.83±4.29）%，高于本研究中仪器法结果。试剂 说 明 书 ADP 终 浓 度 2 μmol／L 和 AA 1.0 mmol／L生物参考区间分别为59.1%～98.3%和63.2%～100%，其下限均与本研究结果存在差异。同时，本研究结果显示，AA 终浓度1.0 mmol／L 时MPAR在CN3000和CS5100 两系统间差异有统计学意义，提示不同检测系统参考区间存在差异，实验室建立或验证本实验室检测系统不同浓度诱导剂诱导的MPAR参考区间则十分重要。

CLSI H58-A文件显示，在不同年龄组间MPAR参考区间差异无统计学意义［3］。邓新立等［12］研究提示60 ～80 岁以上高龄人群中ADP 终浓度5 μmol／L诱导的MPAR结果差异无统计学意义，建议AA终浓度0.25 mmol／L诱导的MPAR在60～69岁人群参考区间为37.12%～88.47%，70 ～90 岁人群参考区间为37.45%～88.97%。本研究局限之处在于募集志愿者年龄20 ～66 岁范围内不同终浓度ADP 和AA诱导的MPAR 在年龄间差异无统计学意义，缺乏在低龄和高龄人群中PAgT 检测结果的参考区间的建立及验证。