心肌肌钙蛋白Ⅰ检测方法的性能评价*

刘春燕，邓朝晖，宋颖博，梁学立，葛若卿，张新（新疆生产建设兵团医院＆石河子大学医学院第二附属医院检验科，乌鲁木齐 830002）

心肌肌钙蛋白（cardiac troponin，cTn）是心肌损伤的特异性标志物［1］。2020 年欧洲心脏病学会发布的指南中突出了高敏心肌肌钙蛋白（high-sensitive cardiac troponin，hs-cTn）在非ST段抬高型急性冠脉综合征（non-ST-segment elevation acute coronary syndrome，NSTEACS）诊断中的作用，标志着急性心肌梗死（aeute myocardial inraretion，AMI）的诊断标志物进入高灵敏度检测的时代［2］。hs-cTn 是指用高灵敏度的方法测定cTn，普遍认为高灵敏度方法检测cTn的能力要满足健康人群中测量cTn 浓度在低于第99 百分位值时的检出率至少达50%以上，且健康人群参考区间上限第99 百分位值的变异系数（coefficient of variation，CV）≤10%［3］。但目前国内外临床诊疗中应用众多不同厂家的hs-cTn试剂盒，hs-cTn检测方法学尚未实现标准化，检测灵敏度及低值检测稳定性方面良莠不齐，需要引起高度重视［4-5］。因此，各实验室在选择不同厂家的hs-cTn试剂时，应评估检测试剂的分析性能。本研究对雅培公司的高敏心肌肌钙蛋白I（high-sensitive cardiac troponin I，hs-cTnI）进行分析性能评价及表观健康人群生物学变异的评估，且建立了本实验室hs-cTnI第99百分位值参考上限（99thURL）。

1 对象与方法

1.1 研究对象 表观健康人组：纳入体检中心表观健康个体350例，男性194例，中位年龄39.5岁，女性156例，中位年龄43.0 岁。纳入标准：（1）无心血管疾病、肺部疾病、肾病、糖尿病、高血压等，半年内无心脏手术，无急性炎症、剧烈运动；（2）心电图检查无明显异常；（3）年龄≥18 岁。排除标准：（1）患有心脏瓣膜病、房颤、心肌炎、心包炎及病窦综合征等心源性疾病者；（2）拒绝抽血行hs-cTnI检验及资料不全的患者。其中，244 例表观健康个体的血清标本用于本实验室hs-cTnI 的99thURL 建立，22例用于评估hs-cTnI 长期和短期生物学变异，84例用于高浓度血清样本倍比稀释。AMI 组：纳入2020年3月至9月在新疆生产建设兵团医院急诊科或心内科诊断为AMI 的住院患者共60 例，中位年龄63.0岁，男性44例，女性16例，AMI患者的确诊符合2015年ESC的诊断标准［6］。本研究经兵团医院医学伦理委员会批准（批准文号：20200101），研究对象均自愿参加本研究并签署知情同意书。

1.2 标本采集与处理 采血前AMI患者和表观健康个体需空腹8 h，采集坐位肘前静脉血，注入5 mL带分离胶的促凝管，3 000×g 离心10 min 后，分别配制新鲜混合血清。采用ARCHITECT 原装配套hs-cTnI稀释液倍比稀释各项目低浓度新鲜混合血清，用于hs-cTnI分析性能评价。

1.3 主要仪器和试剂 雅培公司ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析仪及原装配套hs-cTnI 检测试剂盒（批号：27305UD01）、校准品（批号：26305UD01）及2个水平质控品（批号：28499UD01）。

1.4 空白限（LoB） 用ARCHITECT 原装配套hs-cTnI稀释液作为空白样品，依据EP17-A2 文件［7］要求：每个空白样品每天检测2 批，间隔时间大于2 h，每批重复检测6次，连续检测5 d，获得60个检测结果。依据国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）推荐在规定水平的Ⅰ类错误下，设定α ＝5%，采用非参数检验将空白样品的检测结果按从小到大排列，第95 百分位数即为LoB［8］。

1.5 检出限（LoD） 采用表观健康人群新鲜混合血清倍比稀释成8 个低浓度样品，理论浓度分别为：0.1 ng／L、0.4 ng／L、0.7 ng／L、1.0 ng／L、1.3 ng／L、1.6 ng／L、1.9 ng／L 及2.2 ng／L。每个浓度样品每天各检测2 批，每批重复检测2 次（取均值），连续检测5 d，获得80个检测结果。因低浓度样品常呈非正态分布，因此依据ISO 的要求，采用非参数检验，在规定Ⅱ类错误水平β ＝5%的条件下，确定LoD。则LoD ＝LoB+DS，β（DS，β是低浓度样品测定值的中位数和第5百分位数的间距）［7-8］。

1.6 定量检出限（LoQ） 依据临床要求和室间质量评价的允许误差［7］，设定本实验室hs-cTnI 的总误差目标为15%～20%，在不考虑分析偏差的条件下，总误差＝2CV，如果低浓度样品的CV≤1／2总误差，则LoQ＝LoD［7-8］。

1.7 功能灵敏度 参照文献［9］，将hs-cTnI 高值血清混合样品（H：100.0 ng／L）4 mL 与表观健康人混合血清（L）40 mL，以1H ∶9L 将高值样品稀释至10.0 ng／L，检测3次取均值（M）。将M作为原液，K为原装配套hs-cTnI 稀释液，倍比稀释10 个浓度，浓度范围为1.0 ～10.0 ng／L。以10M ∶0K、9M ∶1K、8M ∶2K、7M ∶3K、6M ∶4K、5M ∶5K、4M ∶6K、3M ∶7K、2M ∶8K及1M ∶9K混合各1.0 mL，最终理论浓度（由高到低）分别为10.0 ng／L、9.0 ng／L、8.0 ng／L、7.0 ng／L、6.0 ng／L、5.0 ng／L、4.0 ng／L、3.0 ng／L、2.0 ng／L 及1.0 ng／L。每天检测上述系列浓度血清，连续检测10 d，计算天间CV 值，以hs-cTnI系列浓度为横坐标、CV为纵坐标作图，计算CV＝10%时hs-cTnI 浓度值，设为该方法的功能灵敏度。

1.8 精密度 依据WS／T 492—2016 行业标准［10］，用表观健康人群新鲜混合血清倍比稀释hs-cTnI高值样品，配制浓度分别为20.0 ng／L（L）、190.0 ng／L（M）及15 100.0 ng／L（H）。每天测定1个分析批，每批3个浓度水平，每批重复3 次，连续检测5 d。计算批内、批间精密度，与厂商提供的性能参数相比较，判断其符合性。

1.9 线性范围 将hs-cTnI 高值混合血清样品（H：44 924 ng／L）和 低 值 混 合 血 清 样 品（L：19.0 ng／L），以5H ∶0L、4H ∶1L、3H ∶2L、2H ∶3L、1H ∶4L、0.7H ∶4.3L、0.3H ∶4.6L、0.1H ∶4.9L及0H ∶5L混合各1.0 mL，最终理论浓度（由高到低）分别为45 000.0 ng／L、36 000.0 ng／L、27 000.0 ng／L、18 010.0 ng／L、9 000.0 ng／L、6 310.0 ng／L、3 610.0 ng／L、920.0 ng／L 及19.0 ng／L。每个样品重复测量3次，取均值。将实测值与预期值进行比较，以预期浓度值为横轴，实际测得浓度值均值为纵轴作线性回归图，计算回归方程：Y ＝aX+b 与相关系数（r）。决定系数（R2）≥0.95为符合要求。

1.10 生物学变异 短期生物学变异：采集22例表观健康人1 d内连续5个时间点（每隔2 h 1次）的血液标本，将血清分装后于-80 ℃保存。长期生物学变异：采集22名表观健康人连续6 周、每周同一时间点的血液标本，将血清分装后置于-80 ℃保存。上述每个标本重复检测2 次，取均值，分别计算个体内变异（CVi）、个体间变异（CVg）、总变异（CVt）及天内和天间个体指数。

1.11 表观健康人群hs-cTnI的99thURL建立 收集本院体检中心244例表观健康人的血清样品，依据C28-A3 文件［11］，按性别分为男性组和女性组（每组人数≥120 人），确定2 组表观健康人的99thURL。

1.12 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，非正态分布的计量资料用中位数表示。非正态分布的计量资料的比较采用秩和检验，男、女性两独立样本间的比较采用Mann-Whitney U 检验。率的比较采用χ2检验。采用回归分析中的线性相关进行相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LoB LoB ＝［重复检测次数×（95／100）+0.5］＝57.5位置上的结果，即第57 和58 个检测值的均数。将60个空白样本检测值按从小到大排序后，第57和58 个检测值分别为0.4 和0.5 ng／L，见表1。故LoB为0.45 ng／L。

表1 60个空白检测值由小到大排序结果

2.2 LoD LoD＝LoB+DS，β，其中DS，β为第40.5百分位数和第4.5 百分位数的间距。hs-cTnI 低浓度样本测定结果见表2。因此，LoD为1.45 ng／L。

表2 hs-cTnI低浓度样本测定结果

2.3 LoQ 设定hs-cTnI 的总误差目标为15%～20%，在不考虑分析偏差的条件下，允许总误差（TEa）＝2CV，即CV ＝1／2TEa。hs-cTnI 浓度在1.90 ng／L时日间CV值为6.6%（＜7.5%），符合质量目标要求。因此，LoQ＝1.90 ng／L，见表3。

表3 系列低浓度hs-cTnI的日间CV（%）

2.4 功能灵敏度 依据hs-cTnI 测定CV≤10%的要求，CV＝10%时对应的浓度值为1.93 ng／L，因此该方法的功能灵敏度为1.93 ng／L，见图1。

图1 hs-cTnI系列低浓度CV图

2.5 精密度 hs-cTnI批内及批间不精密度结果以变异系数（CV）表示，均＜10.0%，符合质量要求，见表4。

表4 hs-cTnI检测不精密度（%）

2.6 线性范围 在19～45 000 ng／L范围内，hs-cTnI线性方程为Y ＝1.030 2X-42.179，R2＝0.997 7，临床可报告范围满足厂商说明书要求，见图2。

图2 hs-cTnI的线性范围回归曲线

2.7 生物学变异 22名表观健康人的短期生物学变异及长期生物学变异见表5。

表5 hs-cTnI短期和长期生物学变异

2.8 表观健康人群hs-cTnI 的99thURL 建立 hs-cTnI的99thURL 为8.25 ng／L，男性和女性分别为9.52 ng／L和8.28 ng／L，女性组低于男性组（Z ＝-2.616，P＜0.05），见表6。不同性别组hs-cTnI 浓度显著低于厂商说明书参考区间，见图3。

表6 表观健康人群hs-cTnI检测结果及99th URL

图3 不同性别及年龄hs-cTnI浓度分布

3 讨论

cTn 的临床应用从根本上改善了ACS 患者的诊断、预后和治疗，其对AMI 的诊断被国际指南列为Ⅰ级a类推荐［12］。随着cTn 检测灵敏度的不断提高，不同cTn检测试剂盒生产商选用不同的捕获抗体和检测抗体、不同的发光系统及检测体系，因此各品牌检测试剂盒间的检测值存在较大差异，使其在AMI患者早期诊断方面的安全性和有效性受到了挑战和质疑［13-14］。本研究依据美国临床和实验室标准协会（CLSI）EP17-A2 文件及国内行业标准的相关要求，对基于化学发光微粒子免疫检测法的试剂盒从LoB、LoD、LoQ、功能灵敏度、精密度、线性范围等方面对hs-cTnI 检测试剂盒进行了验证，结果显示该试剂盒检测效能均符合临床需求。

本研究LoB 结果为0.45 ng／L，低于厂商说明书（1.0 ng／L），LoD为1.45 ng／L，LoQ为1.90 ng／L，验证了试剂说明书声明的性能。为避免基质效应的干扰，本研究采用新鲜血清倍比稀释hs-cTnI 系列低浓度样品，评估该检测系统的功能灵敏度［9］，结果显示CV ＝10%的最低浓度值为1.93 ng／L，临床医生可放心使用浓度高于1.93 ng／L 的hs-cTnI结果。hs-cTnI精密度结果显示，低、中及高浓度样品的批内和批间CV 均＜10%，除低浓度样品批间CV为7.60%以外，其余均满足厂商说明书hs-cTnI第99百分位数的精密度（CV ＝4.0%）。其中，低浓度样品CV 值偏高，可能是由于本实验采用新鲜混合血清倍比稀释hs-cTnI 系列低浓度样本，样品保存时间及条件均会影响hs-cTnI 检测结果的稳定性［15］，也可能与新鲜血清样品反复冻融有关［16］。本研究短期和长期的CVi和CVg均大于宋凌燕等［9］对hs-cTnT生物学变异的试验结果，这可能与使用的分析系统、试验的不精密度及两者检测方法的检测低限数量级不同等原因有关。个体化指数有效地反映了个体检测结果波动的意义，临床对于AMI 疾病的诊断及治疗判断，需要参考个体化指数，合理选择治疗方案，为个体化治疗提供有价值的实验室数据。

本研究建立的hs-cTnI总体人群的99thURL为8.25 ng／L，男性为9.52 ng／L，女性为8.28 ng／L，所得结果与已报道的北京地区使用相同试剂盒、相同标本类型的研究结果大体一致［17］，但显著低于厂商说明书（男性34.2 ng／L，女性15.6 ng／L）和国内其他地区［18］，这与hs-cTnI 存在年龄、性别及种族差异相关［19-21］，也可能与表观健康人群入选标准存在差异相关［22］。而表观健康男性人群的hs-cTnI值高于女性［23］，本研究结果亦印证了这点。本研究纳入hs-cTnI的99thURL 研究样本偏小，结果存在一定的局限性，Apple等［24］提议用于建立hs-cTnI的99thURL健康个体数应大幅增加。因而，本实验室将进一步建立多中心、大样本的适用于新疆地区表观健康人群hs-cTnI 的99thURL，为本地区成年人AMI疾病的诊断及治疗提供实验室基础。

总之，本研究对雅培公司i2000SR全自动免疫分析仪检测的hs-cTnI试剂盒进行了分析性能评价及表观健康人群生物学变异的评估，为临床提供准确、可靠的hs-cTnI检测结果，并初步建立本实验室hs-cTnI的99thURL，因样本量偏小，存在一定的局限性，尚需今后进一步探讨。