不同培养条件下丝状真菌Vitek质谱鉴定结果分析

袁凯旋，姜颖璐，周典蓉，余楠（.南方医科大学检验与生物技术学院，广州 5055；2.广东省人民医院检验科，广州 50080；.广州医科大学附属第四医院检验科，广东增城 56；.中山大学中山医学院，广州 50080）

丝状真菌的快速准确鉴定对侵袭性真菌感染的治疗尤为重要。由于丝状真菌形态复杂、生长缓慢等特点，形态学鉴定有一定局限性；基因测序虽为金标准［1］，但对实验室水平要求高，耗时长，亦无法常规开展。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术可通过检测特异性蛋白质形成的图谱实现快速准确鉴定，已成熟应用于临床微生物实验室的日常工作，尤其是在细菌鉴定方面，但在丝状真菌鉴定方面应用较少，因为丝状真菌影响因素较多、破壁困难且厂家提供的标准化操作文件对其培养条件缺乏客观标准，鉴定效果不尽人意。因此，本研究以Vitek MS为技术平台，评价丝状真菌在不同培养温度、培养基、培养时间下对质谱鉴定结果的影响，优化丝状真菌质谱鉴定的培养条件。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集2020年5月至2021年11月广东省人民医院临床分离的丝状真菌148 株，均经基因测序和形态学确认，其中曲霉属89 株，非曲霉丝状真菌59 株（毛霉目18 株、镰刀属17 株、青霉属／拟青霉属11 株、其他丝状真菌13 株），纳入菌株均在评估质谱鉴定数据库中涵盖。

1.2 主要仪器与试剂 PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司），Vitek MS 质谱仪（法国生物梅里埃公司），光学显微镜（日本Olympus 公司），霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），CO2培养箱（美国FORMA公司）；一次性靶板、基质液、70%甲酸（法国生物梅里埃公司），乙腈（天津科密欧公司），沙氏葡萄糖培养基（SDA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（江门凯琳公司），Ezup 柱式真菌基因DNA抽提试剂盒、通用引物ITS1 和ITS4、Taq PCR Master Mix（上海生工生物公司）。

1.3 形态学鉴定 将菌株转种SDA培养基，28 ℃培养2～5 d，采用透明胶带法［2］在显微镜下观察菌丝及孢子形态特征。对于部分产孢不良菌株采用小培养法［3］进行辅助鉴定。

1.4 基因测序 按照Ezup 柱式真菌DNA 抽提试剂盒说明书提取DNA，采用ITS1 与ITS4 引物［4-5］进行PCR扩增。扩增体系为50 μL，包括Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA 模板5 μL，0.2 μmol／L 上、下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL。扩增条件：94 ℃3 min；94 ℃60 s，56 ℃30 s，72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃7 min。对于部分无法鉴定的菌株使用EF-1α［4］或β-tubulin［6］进行测序，引物信息见表1。由上海生工生物公司完成测序，结果经NCBI 和Mycobank数据库进行比对，种、属信息鉴定原则参照文献［4］。

表1 本研究所用引物相关信息

1.5 方法

1.5.1 培养基及温度的筛选 将菌株分别接种于SDA和PDA，并分别放置于28 ℃和37 ℃培养箱中培养2 d，同一时间挑取上述4 种不同培养条件（SDA 28 ℃、SDA 37 ℃、PDA 28 ℃、PDA 37 ℃）下的菌落进行质谱鉴定，根据其鉴定率差异筛选最佳培养基及温度。

1.5.2 培养时间的筛选 确定最佳培养基及温度后，将菌株培养至第2、3、4、5、6、7、8、9 天，分别进行质谱鉴定，比较不同培养天数下的质谱鉴定情况，确定最佳培养时间。

1.5.3 甲酸-乙腈提取法 根据制造商提供的方案，用潮湿的拭子收集1～2 cm直径的真菌，将其悬于含900 μL 70%乙醇的2 mL 无菌EP 管中灭活10 min，涡旋震荡混匀，10 000 ～14 000×g 离心2 min，弃上清液，待乙醇完全挥发后加入40 μL 新鲜配制的70%甲酸涡旋震荡混匀3 s，加入40 μL乙腈涡旋震荡混匀3 s，10 000 ～14 000×g 离心2 min，取1 μL上清液点靶2 次，干燥后覆以1 μL基质液，待干燥后进行检测，采用Vitek MS 数据库（IVD v3.2）进行判断。每株菌株重复检测2 次，若第1次无鉴定结果，则按照上述流程再次进行检测，若第2次仍无结果，则认为鉴定失败。

1.6 统计学分析 用SPSS 26.0 软件进行数据分析。率的比较采用χ2检验，采用Bonferroni法进行多组间两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养基及温度对鉴定结果的影响 148 株丝状真菌在4种培养条件下（SDA 28 ℃、SDA 37 ℃、PDA 28 ℃和PDA 37 ℃）的鉴定率分别为83.11%、81.76%、70.95%、69.60%，差异有统计学意义（χ2＝12.274，P ＝0.007）。经两两比较，SDA 28 ℃组的鉴定率优于PDA 37 ℃组，差异有统计学意义（P＜0.05）；SDA 37 ℃组的鉴定率虽优于PDA 28 ℃组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 培养基和温度对Vitek MS鉴定能力的影响［n（%）］

2.2 不同培养基及温度下菌落及质谱图谱特点 对于烟曲霉、黑曲霉和少根根霉，37 ℃相比28 ℃下产孢量更大，在SDA生长速度较PDA快，茄病镰刀菌37 ℃下生长不良，产孢受抑制（图1）。烟曲霉、黑曲霉和少根根霉在SDA 28 ℃条件下获得的质谱图谱相比其他条件更密集，特征峰更多，丰度更高，质量最优（图2）。

图1 部分菌株在不同培养基及培养温度下培养2 d的菌落特点

2.3 培养天数对鉴定结果的影响 综合质谱鉴定率和不同培养条件下图谱质量，以SDA 28 ℃为培养条件，将菌株培养至第2、3、4、5、6、7、8、9 天分别进行质谱鉴定，鉴定率依次为89.86%、87.83%、76.35%、66.89%、62.83%、63.51%、59.04%、50.05%，不同培养天数下的鉴定率差异有统计学意义（P＜0.05），其中第2 天与第3 天鉴定率均较高；随着培养时间的延长，培养第4 ～9 天得到的鉴定率明显下降，培养至第9 天得到的鉴定率仅为50.05%，见表3。培养天数对毛霉目组和其他真菌组鉴定率的影响较为突出，对曲霉属组、镰刀属组、青霉属／拟青霉属组影响较小，其中对曲霉属组的影响最小。

表3 培养天数对Vitek MS鉴定能力的影响［n（%）］

2.4 不同培养时间下菌落及质谱图谱特点 培养初期（2～3 d）菌落颜色较浅，以菌丝和孢子为主，随着培养时间延长，孢子成熟菌落色素加深，产孢量增大，主要以孢子为主（图3）。培养初期（2 ～3 d）获得的质谱图谱质量更优，特征峰数目多，随着培养时间延长，在4 d 后特征峰数量表达减少，部分特征峰发生偏移（图4）。

图3 部分菌株在SDA培养2～8 d的菌落特点

图4 不同培养时间下烟曲霉、黑曲霉和少根根霉的质谱图谱特点（自下而上：2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）

图2 不同培养基及温度下烟曲霉、少根根霉和黑曲霉的质谱图谱特点（自上而下：PDA 37 ℃、PDA 28 ℃、PDA 28 ℃、SDA 28 ℃）

3 讨论

本研究共收集148株28种丝状真菌用于评估不同培养温度、培养基、培养时间下对Vitek MS 鉴定能力的影响，菌株分布情况基本覆盖临床常见丝状真菌。本研究培养条件的选择主要基于以下原因［7-8］：液体培养基很少用于临床实验室且有雾化孢子污染的风险；此外，液体培养基难以肉眼鉴别污染情况；SDA 和PDA 为临床实验室广泛使用的真菌培养基且易于肉眼鉴别污染；直接从固体培养基获取菌落，可简化样品制备流程；适合丝状真菌生长的2个温度为28 ℃和37 ℃，高于或者低于这2个温度可能会影响真菌的生长；大部分实验室常规培养丝状真菌的时间为1～2周。

本研究共设置4种培养条件组合，实验发现受试菌株在SDA 培养基28 ℃培养条件下得到的质谱鉴定率最高（83.11%），所获得的质谱图谱质量优于其他培养条件，可见SDA 28 ℃为适合丝状真菌生长的最佳条件组合。就培养时间而言，随着培养天数的延长，受试丝状真菌的鉴定率呈明显的下降趋势。究其原因，可能是本研究基于Vitek MS平台，该平台丝状真菌数据库的建库谱图主要以丝状真菌在SDA培养后收集菌体进行MALDI-TOF MS分析有关；而且37 ℃培养条件更利于曲霉等丝状真菌产生孢子而28 ℃适合菌丝体生长，但是亦有部分丝状真菌在37 ℃下生长不良，产孢受抑制（图1）；再者，PDA亦可促进真菌产生孢子导致破壁困难，难以充分释放核糖体蛋白成分，从而影响图谱质量，导致低分值或无结果，SDA和PDA所含各营养成分及含量有差别，以致丝状真菌获取的营养物质、产孢数量、菌丝数量亦有区别，从而可能导致质谱图谱的差异［9-11］。但是，无论在何种培养条件下，随着培养天数的延长，丝状真菌不同生长时期呈现不同的生长特点，早期主要以菌丝为主，中期以菌丝和孢子为主，晚期则以孢子为主［12-13］。晚期挑取菌落难以获得菌丝，细胞壁随生长时间增厚，孢子破壁比菌丝更困难［7，14］；有研究发现培养时间120 h 是最佳时间点，能够得到高质量的谱图［12］。但本实验显示，从培养第2 天开始检测到第9 天，在培养初期（2 ～3 d）图谱质量最优，鉴定率最佳，但随着时间的延长，图谱质量特征峰反而减少，质量下降。再者可能是丝状真菌成熟，黑色素产生增多，黑色素影响MALDI-TOF MS的电离过程导致鉴定效果不佳［15］。因此，在培养2 ～3 d 质谱鉴定率较高，此时可获得较高质量的质谱图谱。

不同实验室真菌分离情况与构成比不同，且不同真菌生长情况亦有差别，适合质谱鉴定的最佳时间亦有地区、菌株差异，在质谱鉴定时需将菌株培养至长出菌丝，选择在产孢前或产孢时进行鉴定，这时核糖体蛋白表达充分，避免难破壁孢子或色素的干扰。为了更好地利用Vitek 丝状真菌数据库，建议对大部分生长速度较快的丝状真菌培养2 ～3 d进行质谱鉴定，可缩短鉴定所需时间，及时为临床提供病原学诊断。

综上所述，本实验室以Vitek MS为丝状真菌鉴定平台，使用SDA培养基在28 ℃下培养2 ～3 d 进行质谱鉴定，可获得较为理想的鉴定效果和较高质量的质谱图谱。