彩色甘蓝型油菜指纹图谱构建

罗玉秀，雷帆，滕守连，崔小青

（1 青海大学生态环境工程学院，青海西宁 810016；2 青海省海东市民和县总堡乡农业综合服务中心，青海海东 810800）

油菜是我国种植最为广泛的油料作物[1]，青藏高原海拔高、气候冷凉，植物生长季节短，适宜油菜种植[2]，既能保证农业收入，又能增加旅游收入。因而在休闲农业中得到了广泛运用，种植面积有所增加[3]。原本大面积种植青稞的地区，现以油菜和青稞相间呈带状或条块状种植，展现出别样的魅力[4]。

油菜作为观赏植物大面积种植时，花色单一，易引起视觉疲劳[5-6]。近年来，育种学家以同属十字花科的萝卜和诸葛菜为彩色基因供体，通过远缘杂交技术，创制出彩色油菜资源，各大实验室利用这些资源，开展了彩色油菜品种（系）选育工作[7]。本研究在青藏高原植物资源保护与利用实验室开展了相关研究工作，并选育出多个彩色甘蓝型油菜品种（系）。在以油菜为主题的休闲农业区，搭配种植不同花色的彩色油菜，营造大面积、多元化的观赏景观，对游客具有更大的吸引力和震撼力，可促进休闲农业发展。目前，彩色油菜种子市场需求量较大，其质量优劣直接影响观赏价值和经济价值[3]。因此，快速、有效地鉴定彩色油菜种子的纯度和真实性十分有必要。

形态学鉴定和分子鉴定是鉴定作物品种的常用方法。形态学鉴定虽然操作简单，但耗时长，易受环境和人为因素的影响[9]。DNA 分子标记技术是快速、准确、高效的分子鉴定技术，该项技术的发展为育种学家研究作物性状的遗传特性奠定了良好的理论基础，也为品种纯度和真实性鉴定提供了强有力的技术保障[10]。该技术不受取材部位、取材时间和环境的影响，大大提高了鉴定的准确性，缩短了鉴定时间，是最为科学有效的鉴定品种（系）纯度和真实性的方法。

近年来，分子标记指纹图谱在作物品种鉴定、注册、质量监测及知识产权保护等方面起到不可替代的作用[8]，可用于构建指纹图谱的DNA 分子标记方法有多种，如RFLP[10]、RAPD[11]、SRAP[12]、AFLP[13]、ISSR[14]、SSR[7，8，15]、特异性标记[16]等。其中，SSR 标记覆盖整个基因组，对DNA质量和数量要求不高，操作简单，具有位点多态性高、条带重复性佳、试验稳定性强、共显性遗传等多个优点。因此，在DNA 分子标记技术中脱颖而出，成为构建指纹图谱最常用的手段[7，8，16]。SSR 技术已广泛应用于玉米[17]、水稻[18]、油菜[19-20]、大豆[21]等作物指纹图谱构建和品种纯度鉴定研究中。在青藏高原植物资源保护与利用实验室，已用该项技术构建青海省主栽春油菜品种指纹图谱[9]。

1 试验目的

从509 对SSR 引物中，筛选出7 对材料间具有多态性的SSR 引物，从30 对特异性引物，筛选出6 对材料间具有多态性的引物，并用13 对引物构建10 份彩色油菜品种（系）的指纹图谱。旨在为开发春性彩色油菜分子鉴定技术标准，快速有效鉴定市场流通彩色油菜的真实性和质量提供依据。

2 材料与方法

2.1 供试材料

本研究材料共10 份，包括8 个彩色甘蓝型油菜品种（系）、1 个甘蓝型油菜常规品种（青油14 号）、1 个春性甘蓝型油菜杂交品种（青杂5 号）。青杂5 号和青油14来源于种子实体店，R4、P1 和P2 来源于江西农业大学，其他材料于实验室选育（见表1）。选出饱满的种子分别种植于花盆，并在光照培养室培养，每个材料随机选取10 个单株做好标记，用于分子鉴定。

表1 试验材料

2.2 引物

试验所用SSR 引物由生工生物公司合成（见表2）。30 对特异性引物是自行设计并委托生工生物公司合成。

2.3 DNA 提取方法

取油菜幼苗2 叶1 心期的第1 片真叶，采用CTAB法，提取基因组DNA；采用微量核酸蛋白分析仪，测定DNA 浓度和纯度；采用琼脂糖凝胶，检测DNA 质量。各样品DNA 按检测结果配制为50ng/μL 工作液。每个材料10 个单株的DNA 等量混合，建立基因池，用于多态性引物筛选。

2.4 PCR 的扩增体系及扩增条件

PCR 反应用10μL 体系，各成分（见表2）。PCR 反应条件：94℃（2min）；94℃（45s）、59℃（30s）、72℃（45s），共10 个循环，每循环退火温度降低0.5℃；94℃（45s）、54℃（30s）、72℃（45s），共30个循环；72℃（1min）。然后在4℃条件下保存。

表2 PCR 扩增体系

2.5 等位基因检测

用6%聚丙烯酰胺凝胶分离PCR 扩增产物，银染显影后读带。仅记录多态性位点，清晰可辨的多态性位点，有条带记为“1”，无带记为“0”，不清晰记为“3”。利用NTSYS 2.10e 软件对数据进行聚类分析。

3 结果分析

3.1 多态性引物筛选

用509 对SSR 引物对10 份材料的DNA 池进行引物筛选，初步选出12 对多态性较强的引物。进一步筛选结果证明，其中7 对引物的扩增条带清晰、稳定、差异明显。7 对引物共扩增出22 个多态性位点，每对引物扩增2～5 个多态性位点，平均每对引物扩增出3.1 个多态性位点。扩增多态性位点最多的引物为P21，扩增出5 个；扩增多态性位点最少的引物为P27 和P180，只扩增出2 个。多态性比例达40%～100%，扩增条带大小在90～820bp，可用于构建指纹图谱。

由图1 可知扩增结果，由表3 可知当选引物。30 对A2 染色体上的特异引物对10 份材料的DNA 池进行引物筛选，最终筛选出6 对特异性引物，其扩增位点具有多态性，且条带清晰、稳定、差异明显，扩增位点1～3 个，平均2 个。6 对引物共扩增出12 个多态性位点，扩增条带大小在90～550bp，可用于构建指纹图谱。

图1 引物SSR52 的扩增结果

表3 筛选出的SSR 和特异性引物

3.2 指纹图谱构建

当选的7 对SSR 引物和6 份特异性引物，构建10份彩色油菜的基因分型和指纹图谱。PCR 扩增结果经凝胶电泳显影后记录，多态性位点用引物和条带大小表示，品种的指纹图谱用“1”和“0”表示，即为该品种的数码图谱。将每对引物的每个品种数码图谱组合到一起，构成每个品种的数码指纹图谱（见表4）。引物P13 构建的指纹，能将参试材料中的普通黄花油菜与彩色油菜分开，引物P21 构建的指纹，能将10 份材料彼此分开。13对引物共获得10 份材料，32 个多态性位点的340 个信息，其指纹图谱相同概率仅为（1/2）340，说明材料间通过指纹图谱甄别区分的几率极大。

表4 10 份材料的DNA 指纹图谱

3.3 聚类分析

利用NTSYS 2.10e 软件对数据进行聚类分析，并构建10 份材料的聚类分析图（见图2）。在遗传距离0.63处，可将10 份材料分成3 类，其中，彩色油菜及其亲本聚到第Ⅰ类；Y1（浅黄花）和青杂5 号（黄花）分别聚到第II 类和第III 类；彩色油菜中杂交种PY1 和PH1 与其双亲聚在一个亚类，杂交种RH1 与其双亲聚到另一亚类。说明彩色油菜与黄色油菜遗传距离远，青杂5 号与彩色油菜间差异最大，其次是PY1，粉色不育系与紫色不育系遗传距离最近。聚类结果区分出10 份参试材料分子水平的遗传关系，为育种工作进行亲本选配提供了背景参考。

图2 聚类分析结果

4 结论

表型鉴定操作简单，但费时费力，易受主观因素和环境的影响[22]。甘蓝型油菜遗传基础狭窄，可用于品种鉴定的表型标记，仅有籽粒颜色、花色、叶色、生长习性等少数几个，且多数为数量性状，表型差异小，难以区分[23]。花色性状是一个明显的标记性状，但等到花期才能辨别，鉴定周期长。分子标记直接从DNA 水平上反应品种间的遗传多样性，多态性十分丰富[24]。分子标记技术是品种（系）真伪及纯度鉴定的首选方法，具有准确、高效、方便等优点。现有彩色甘蓝型油菜品种（系）指纹图谱的构建，对于育种、品种登记、知识产权保护及生产等环节均有重要意义。

本试验从539 对引物中，筛选出13 对具有多态性的引物，并构建10 种材料的指纹图谱，该图谱能将10份研究材料准确区分开来。图谱中多态性位点用引物及条带大小表示，位点用“1”和“0”表示，清晰明了、分辨率和实用性强，可作为甄别不同材料的工具。聚类分析结果显示，10 种材料之间的遗传相似系数为0.4～0.86，聚类结果与遗传背景相吻合，聚类结果可信。说明SSR 分子标记结合特异性标记构建指纹图谱，能充分反映油菜不同品种之间的遗传差异，在新品种登记、保护、鉴定等方面具有广阔的应用前景。