液相色谱法测定植物源性食品中灭蝇胺

杨飞帆，赵舒景

（上海市崇明食品药品检验所 崇明食品安全检测中心，上海 202150）

灭蝇胺又名环丙氨嗪，可以诱使双翅目幼虫和蛹在形态上发生畸变，成虫羽化不全或受抑制。其可用于控制动物厩舍内的苍蝇以及防治黄瓜、茄子、四季豆、叶菜类和花卉上的美洲斑潜蝇等农业害虫，是一种高效低毒杀虫剂[1]。

根据2021版国家食品安全监督抽检实施细则中的要求，对芹菜、豇豆、菜豆3类蔬菜有灭蝇胺项目的检测要求。随着检测技术的日益发展，植物源性食品中灭蝇胺的检测方法主要有高效液相色谱法[2-3]、液相色谱质谱联用法[4-5]和量子点荧光探针法[6]。根据《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）[7]的规定，蔬菜水果中的灭蝇胺均使用《蔬菜中灭蝇胺残留量的测定 高效液相色谱法》（NY/T 1725—2009）[8]（以下简称标准方法）进行检测，该方法样品经提取浓缩，经SCX柱净化，以达到检测的效果，存在前处理复杂、有机溶剂使用量大等缺点。目前植物源性食品中农药残留的检测的前处理方法有固相萃取[9]、QuECHERS[10]和GPC-GCMS[11]等。本研究是在标准方法的基础上，通过不断改进前处理步骤、减少有机溶剂的使用量、优化检测条件等，达到灭蝇胺检测的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

基质：豇豆（来源为市售产品，经检测后为灭蝇胺阴性样品）。

试剂：乙腈；乙酸铵；甲醇（色谱纯）；灭蝇胺标准溶液（100 µg/mL），农业部环境保护科研监测所。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱Agilent 1260，配有紫外检测器或二极管阵列检测器；电子天平梅特勒-托利多，精度0.01 g；高速匀浆机T18；高速离心机；涡旋仪；移液枪；旋转蒸发仪；氮吹仪；50 mL离心管； 150 mL梨行瓶；各类一次性用品（滴管、贮液器、 0.45 µm有机滤膜、2 mL注射管等）。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

灭蝇胺标准工作使用液的配制：吸取100 µL灭蝇胺标准溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得浓度为1 µg/mL标准工作使用液。

1.3.2 线性分析

准确吸取灭蝇胺标准工作使用液，用乙腈配制 成0 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、 200 ng/mL、400 ng/mL和800 ng/mL的标准系列溶液，注入HPLC，得到色谱图，以保留时间定性。以标准系列溶液中目标物的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 样品前处理

（1）提取与浓缩。准确称取匀浆试样10 g于50 mL 离心管中，加入10 mL乙酸铵-乙腈溶液，高速匀浆2 min，取20 mL乙酸铵-乙腈溶液清洗均质刀头，洗液并入50 mL离心管中，用涡旋仪涡旋混匀1 min，用乙酸铵-乙腈溶液定容至50 mL。经低温高速离心机4500 r/min离心5 min，得到固液分离的状态。

用移液枪准确吸取10 mL上清提取液至150 mL梨形瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩至只含水溶液的状态（冷凝装置无液滴滴下），水浴温度为40 ℃。取下后加入2 mL盐酸溶液，待净化。

（2）净化。依次用5 mL甲醇、水淋洗活化强阳离子交换萃取柱（SCX），当液面到达柱吸附层表面时，立即将带净化的溶液转移至SCX柱中，再用 5 mL盐酸溶液分两次清洗150 mL梨形瓶中残留物，并全部转至SCX柱中。然后依次用5 mL水、甲醇淋洗SCX柱，弃去所有流出液并将SCX柱抽干。将SCX柱置于另一洁净的150 mL梨形瓶上，SCX柱上加贮液器，加入15 mL氨水-甲醇溶液进行洗脱。收集洗脱液，并在旋转蒸发仪上，水浴温度 40 ℃，浓缩至近干，氮吹仪吹干，最后用2 mL乙腈-水溶液复溶，过0.45 µm有机微孔滤膜，上液相色谱 检测。

1.3.4 液相色谱检测条件

色谱柱：NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动 相：乙腈-水溶液（98+2）；流速：1.0 mL/min；进样体积：30 µL；检测波长：215 nm；柱温：35 ℃。

2 结果与分析

2.1 目标物提取方式的选择

农药残留目标物的提取前处理有很多种方式，可选择直接涡旋混匀、超声提取、振荡提取以及均质提取等方式。本法选择均质提取的方式，通过使用阳性样品对比实验数据显示，均质提取法样品提取更完全。

2.2 样品定容方式的选择

标准方法中是称取20 g样品，使用100 mL的比色管定容，并采用布氏漏斗过滤的方式获得提取液。方法存在样品量大、提取溶剂用量大和固液分离方法烦琐等缺点。本法采用的是称取10 g样品，用 50 mL离心管定容，采用离心机进行固液分离，减少了样品和提取溶剂的用量，简化了分离方法，提高了分离效率。

2.3 色谱柱的选择

色谱检测过程中，一般有两类色谱柱可进行选择，即正相色谱柱和反相色谱柱。流动相极性大于色谱柱的为反相色谱，最常见的为C18柱，常用于分离极性化合物。反之为正相色谱，常用于分离弱极性的化合物，灭蝇胺为弱极性化合物，所以选择正相色谱柱NH2柱进行检测。

2.4 流动相的选择

反相色谱柱的使用与正相色谱柱相反，水相比例不宜太大，否则会影响分离效果。标准方法中推荐使用乙腈-水（97+3），实际实验过程中发现，当以豇豆为基质时，存在杂峰与目标峰的分离度达不到检测要求，影响检测效果。通过增加有机相比例，调整乙腈-水（98+2），结果显示分离度完全能达到实验要求，分离效果优于原比例。同时，乙腈-水（98+2）溶液需要提前配制，若将水溶液和乙腈溶液按照2∶98的比例在线混合，会出现因水相占比太低，产生混合不均匀的情况，从而导致目标物的出峰时间存在一定的漂移，影响结果的判定。豇豆中灭蝇胺色谱图见图1。

图1 豇豆中灭蝇胺色谱图

2.5 进样体积的选择

实验发现，当进样量为10 µL时，检出限浓度的响应极小，再加上基质的干扰，很难达到准确检测的目的。通过增加进样量至30 µL，可以使信噪比完全达到实验要求。

2.6 线性相关性

当灭蝇胺浓度为0～800 ng/mL，具有良好的相关性，线性相关系数r＞0.9999，线性回归方程为y=345.73713x-0.291771。

2.7 回收率和精密度

通过豇豆样品加标回收来考察方法的准确度，通过同水平加标的6个平行样品间的相对标准偏差（RSD）来考察方法的精密度。称取18份豇豆样品进行3水平（检出限0.02 mg/kg、方法定量限0.06 mg/kg、最高限量0.5 mg/kg）加标测定。通过标准系列方程读取测定浓度结果，计算样品本底值、加标回收率以及相对标准偏差。回收率和精密度结果见表1。

由表1可知，灭蝇胺加标回收率为75.0%～ 112.0%，相对标准偏差均小于20%，其回收率和精密度均符合检测要求，说明本方法具有良好的准确度和稳定性。

表1 加标回收率和精密度结果（n=6）

3 结论

本研究在标准方法的基础上，对豇豆中灭蝇胺残留检测的前处理方法进行优化，使操作更加简单、高效，减少样品和提取溶剂的用量。灭蝇胺在浓度0～800 ng/mL，均具有良好的相关性，且其回收率、精密度等均可达到项目检测要求，对其他植物源性食品中灭蝇胺的检测也有一定的参考 价值。