脂酰辅酶A长链合成酶3及其相关疾病

张 荣， 陈雁斌， 袁中华*

(1)南华大学心血管疾病研究所，动脉硬化学湖南省重点实验室，湖南省动脉硬化性疾病国际科技创新合作基地，湖南 衡阳 421001；2)湘南学院附属医院神经内科，湖南 郴州 423000)

酰基辅酶A合成酶长链家族(long chain acyl-CoA synthetases，ACSLs)是生物体内不可或缺的一类酶。在细胞内脂肪代谢过程中激活脂肪酸，激活的脂肪酸与腺苷三磷酸结合，释放焦磷酸盐形成脂肪酰基-磷酸腺苷。然后，脂肪酰基-磷酸腺苷与辅酶A结合，同时释放磷酸腺苷和脂肪酰基辅酶A。ACSLs共有5个家族成员，分别是ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5及ACSL6。其中，ACSL3是ACSLs家族中表达最多且功能复杂的一员。1996年，Fujino 等[1]首先从大鼠脑cDNA中分离和鉴定了第三酰基辅酶A合成酶，并命名为第三酰基辅酶a合成酶。2004年，酰基辅酶 A 合成酶协会在人类和小鼠基因组命名委员会的建议下，将第三酰基辅酶a合成酶修改为脂酰辅酶A长链合成酶3(acyl CoA long chain synthetase 3, ACSL3)[2]。ACSL3可激活碳链长度为16 ～ 20的不饱和脂肪酸以及全顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸，并生成蛋黄素以及脂滴[3]。蛋黄素存在于极低密度脂蛋白的表面，是其重要的组成成分。脂滴是细胞内的主要储存中性脂的细胞器，主要有维持脂质动态平衡的作用。有研究表明，当 ACSL3 参与脂滴的合成及自噬等过程，有调节胞内脂质稳态的作用[4]。如果胞内脂质动态平衡被打乱，细胞中蓄积大量脂质引起细胞脂肪变性，将会进一步导致动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)等ACSL3 相关疾病的发生。因此，探究ACSL3与脂质代谢之间的关系和作用机制可为防治其相关疾病提供新的研究线索。

1 脂酰辅酶A长链合成酶3的结构及分布

人类ACSL3基因位于2q36.1，其序列全长83 603 bp，含17个外显子、16个内含子；ACSL3 mRNA有4个剪切变体，可编码720个氨基酸，主要表达79 kD和80 kD的2种蛋白质[4]。ACSL3蛋白含有二硫键7个、磷酸化位点66个，O-糖基化位点9个，N-糖基化位点3个，跨膜区1个。ACSL3蛋白通过无规则卷曲连接，蛋白质结构以α-螺旋和β-转角为主。ACSL3的N末端是其酶活性、吸收脂肪酸和靶向目的蛋白质所必需的。此外，ACSL3的N末端与脂滴亲和力极高，这种高亲和力能使ACSL3在脂滴生成时从内质网(endoplasmic reticulum，ER)转移到脂滴。

ACSL3广泛存在于不同的组织中，例如大脑、心血管、胎盘、前列腺、骨骼肌、睾丸和胸腺等。在细胞内，它主要分布于细胞的脂滴外围和内质网的细胞质面[5, 6]。

2 脂酰辅酶A长链合成酶3在脂质代谢中的作用机制

2.1 ACSL3促进细胞内脂滴的合成

脂滴(neutral lipids，LDs)普遍存在于各种细胞的细胞器，可储存中性脂质，例如甘油三酯(triglyceride，TG)和胆固醇酯(cholesteryl ester，CE)。以前，人们通常认为，脂滴是惰性的储存结构。但越来越多的证据表明，它们是高度活跃的，并在能量和脂质代谢中发挥核心作用。脂滴与许多细胞器接触，包括内质网、线粒体和过氧化物酶体。通常，许多蛋白质从内质网或从细胞质进入脂滴表面。从内质网进入脂滴表面的蛋白质为“I类脂滴蛋白”，I类脂滴蛋白的特征是在无脂滴的情况下存在于内质网中，并在脂滴形成过程中或脂滴通过膜桥与内质网重新连接后转位到脂滴表面。ACSL3属于既存在于生长中的脂滴又存在于成熟脂滴的I类脂滴蛋白质[1]。像大多数I类脂滴蛋白质一样，ACSL3具有发夹样结构的疏水区域，使它能够嵌入内质网膜或脂滴单层表面。

细胞内脂滴以ER-LD接触的方式萌芽，但萌芽具体的机制仍不清楚。Datta等[7]研究发现，HEK293细胞中分选蛋白排序链接素14(sorting nexin 14, Snx14，一种编码分选蛋白的基因)被招募到含有ACSL3的内质网区域，在这个区域新生脂滴开始发芽。细胞内Snx14敲除时，脂滴生成减少且形态不一，而Snx14过表达时，脂滴合成增加。ACSL3在Snx14的上游发挥作用。在Snx14 过表达细胞中，沉默表达ACSL3时脂滴数量减少。证明了ACSL3协助Snx14锚定于脂滴并促进脂滴萌芽。

在内质网萌芽的脂滴在细胞摄入外源性脂肪酸后生长成熟，但是脂滴成熟机制尚不完全清楚。Fujimoto等[8]发现，在人肝细胞HuH7培养基中添加油酸(oleic acid，OA)，细胞内脂滴积累增多，并伴随着ACSL3表达增加。添加ACSL3抑制剂Triacsin C，ACSL3表达减少，伴随细胞内的脂滴含量大幅度降低。说明外源性脂肪酸促进脂滴成熟的过程中ACSL3发挥重要作用。这个作用机制可能是脂滴相关蛋白Rab18(low molecular weight GTP-binding prioten)与PLIN2(perilipin 2)的C末端结合定位于新生脂滴，促进ACSL3定位于新生脂滴LD单层表面，增加细胞内脂滴的含量[9]。ACSL3定位于脂滴单层表面的效率与突触融合蛋白17(syntaxin 17,Stx17) 有关。ACSL3与Stx17的SNARE域相互作用，调节ACSL3的分布，参与脂滴生物合成，Stx17沉默表达后会减少ACSL3向新生脂滴的移位[10]。由于Stx17沉默表达而导致脂滴成熟的缺陷能通过ACSL3过表达来弥补。这表明ACSL3移位到脂滴的效率，影响脂滴的成熟。ACSL3与Stx17这种相互作用发生在内质网-线粒体界面。Chang等[11]用内质网应激诱导剂Brefeldin A (BFA)和Thapsigargin (TG)处理HuH-7细胞时，ACSL3的mRNA表达升高，细胞内脂滴明显增多。如果用ACSL3 siRNA (shRNA 829)沉默表达ACSL3，会抑制内质网应激诱导的脂滴形成与成熟。

总之，ACSL3可通过促进脂滴的形成和成熟参与细胞内脂质代谢(见Fig.1)。

Fig. 1 ACSL3 is involved in intracellular lipid metabolism by promoting lipid droplet formation and maturation (A) The mechanism of ACSL3 in promoting LD synthesis. (B) ACSL3 is involved in the regulation of autophagy. (C) ACSL3 inhibits iron death. →: promote; —|: inhibition;-→ : change

2.2 ACSL3参与自噬的调节

自噬存在于真核细胞中，可以清除有缺陷和不需要的细胞内物质，例如多余的脂质，并在营养缺乏、氧化损伤等环境胁迫下迅速上调，是一种高度保守的降解途径。自噬的启动是细胞内原存在的膜室(例如内质网)形成隔离膜。隔离膜的延伸和关闭吞没细胞内物质后形成自噬体。自噬体与溶酶体的融合形成了自溶酶体，其中捕获的物质被溶酶体水解酶大量降解。

心肌细胞中ACSL3同家族的ACSL1参与自噬的调节。ACSL1表达缺陷时，雷帕霉素复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)激活，从而抑制自噬。在自噬的启动过程中，γ-氨基丁酸受体相关蛋白(γ-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP)和自噬标志物LC3s(microtubule associated protein 1 light chain 3 and homologs，LC3s)与吞噬体的外膜和内膜相关，并调节膜扩张、载物受体募集、吞噬体闭合和自噬体与溶酶体的融合[12]。ACSL3可通过LC3相互作用区(LC3-interacting region，LIR)结合GABARAPL2[13]，促进GABARAPL2在内质网上的定位及维持GABARAPL2的稳定性。ACSL3基因敲除GABARAPL2蛋白表达水平降低。相反，ACSL3缺失后，微管相关蛋白 1 轻链 3 β(Microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B)蛋白水平显著升高。这些研究表明，ACSL3可能参与自噬的调节。

2.3 ACSL3抑制铁死亡

铁死亡与其他形式的细胞死亡不同，其特征是铁依赖的毒性脂质活性氧( reactive oxygen species，ROS)的积累和由此造成的膜损伤，是一种非凋亡细胞的特殊细胞死亡形式。因此，细胞铁死亡的起始和发展都与脂质代谢密切相关。ACSL3可激活外源性单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)，降低质膜脂质在数小时内对氧化的敏感性，防止铁死亡过程中质膜上脂质ROS的积累，有效地抑制铁依赖性氧化细胞死亡的过程[14]。此外，油酸通过ACSL3合成磷脂，从而保护黑色素瘤细胞免于铁死亡。ACSL3表达降低时，用于合成磷脂的油酸显著减少。而野生型ACSL3的过表达时，合成磷脂的油酸明显增多，并且保护黑色素瘤细胞免于铁死亡，并增加其形成转移性肿瘤的能力[15]。研究表明，ACSL3与铁死亡密切相关，且有保护细胞免于铁死亡的作用。

3 脂酰辅酶A长链合成酶3与相关疾病

3.1 ACSL3与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是以脂质代谢障碍和炎症为病变基础的复杂病理过程。其病理性标志细胞即泡沫细胞是巨噬细胞和血管平滑肌细胞吞噬大量脂质而形成。泡沫细胞摄入的脂质以脂滴的形式贮存在细胞内。

动脉内膜脂质蓄积是动脉粥样硬化的起始阶段，脂滴是脂质的重要储存场所，故探究脂滴的形成对预防动脉粥样硬化的意义极大。Deng等[9]研究发现，小鼠成肌纤维细胞中，定位在脂滴上的ACSL3减少或ACSL3的活性被Triacsin C抑制时，脂滴数量减少。脂滴上聚集的ACSL3增多时，脂滴数量增加[16]。脂滴的生成增多加重动脉内膜脂质蓄积，进而促进动脉粥样硬化。随着动脉粥样硬化发展，纤维组织增生及钙化物沉积、动脉中膜脱落和钙化，动脉壁逐渐加厚僵硬、血管腔进一步堵塞狭窄。在人主动脉平滑肌细胞[3]中，ACSL3过表达时，骨相关蛋白基因(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)的表达增加；分别用敲除ACSL3及添加ACSL3的抑制剂triacsin C抑制ACSL3表达时，均可有效阻止骨相关蛋白和钙沉积基因的表达。ACSL3表达增加会加重动脉钙化进一步促进动脉粥样硬化的发展。

动脉粥样硬化常同时伴随着脂质代谢紊乱和炎症，Jung等[17]研究发现，在人冠状动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞中，肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)促进ACSL3的表达。用油酸孵育这2种细胞，细胞内脂滴数量增加，且TNF-α促进的脂滴形成需要ACSL3基因的参与。研究表明，ACSL3即参与了动脉粥样硬化的炎症反应，又与动脉粥样硬化脂代谢紊乱有关。

这些研究均表明，ACSL3与动脉粥样硬化密切相关，且有加重动脉粥样硬化的风险。进一步研究ACSL3促进脂滴形成的机制，有助于防治动脉粥样硬化等脂质代谢等相关疾病(见Fig.2)。

3.2 ACSL3与非酒精性脂肪肝病

非酒精性脂肪性肝表现为肝细胞内脂质代谢紊乱、脂滴大量蓄积，如不及时有效治疗，可导致脂肪性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。已有研究表明，非酒精性脂肪性肝病与ACSL3有关，ACSL3有加重非酒精性脂肪性肝病的风险。Poppelreuther等[18]在高脂饲养的大鼠体内检测到肝组织中ACSL3表达增高，脂质蓄积明显增加；沉默表达ACSL3后时大鼠肝组织中脂质蓄积减少。在HepG2细胞中ACSL3 mRNA表达水平降低时可减少细胞中脂滴的形成[19]。表明ACSL3是肝细胞脂滴形成的关键调节因子，间接促进了非酒精性脂肪肝病的形成。ACSL3是受炎症因子(oncostatin M，OSM)调控的基因，OSM有改善肝损伤引起的高甘油三酯血症的作用，表明ACSL3可能在肝损伤修复的调节中也发挥作用[20]，但其具体的研究机制尚未有报道。进一步研究ACSL3在肝细胞中的作用机制，有望对预防和治疗非酒精性脂肪性肝病带来新的希望(见Fig.2)。

3.3 ACSL3与糖尿病

糖尿病是一系列以血糖升高为特点的糖代谢异常性疾病。而血糖升高的病因通常是胰岛素分泌异常或胰岛素功能障碍。

胰岛可通过分泌胰岛素从而维持血糖的稳定。在人胰岛β细胞(pancreatic beta cells)和大鼠胰岛中，ACSL3蛋白存在于胰岛素分泌颗粒中。Ansari等[21]通过shRNA介导沉默表达ACSL基因，利用INS-1 832/13细胞获得了稳定的ACSL敲除细胞系。ACSL3基因敲除后，由于葡萄糖(glucose)刺激而分泌的胰岛素(insulin)减少了一半，细胞内葡萄糖显著升高。

小肠上端对脂质的感应(通过脂质内输注实现)可激活肠脑轴以降低葡萄糖的合成和血糖水平。Bauer等[22]报道，高脂饲料喂养小鼠时会损害小肠上端对脂质的敏感性，并降低小鼠肝细胞中ACSL3表达水平。当敲低小鼠50%的ACSL3时可阻止钙离子通道(胰岛素分泌的重要信号)打开，损害脂肪酸传感途径，从而影响全身葡萄糖的体内稳态。Liu等[23]研究结果强调，参与脂质代谢和升糖通路的ACSL3基因表达与糖尿病呈负相关。沉默ACSL3基因的表达可以抑制胰腺β-细胞中胰岛素释放，同时，ACSL3表达减少会损害蛋白质激酶B的磷酸化，导致胰岛素抵抗。因此，降低ACSL3的表达可影响胰岛素分泌，导致胰岛素抵抗增加患糖尿病的风险(见Fig.2)。

3.4 ACSL3与肿瘤

目前肿瘤仍是导致人类死亡的主要疾病，其特征包括细胞自身提供生长信号、多种物质代谢失调、组织侵袭和转移以及逃避程序性细胞死亡等，探究肿瘤的代谢机制，寻找鉴别肿瘤的方法对防治肿瘤尤为重要。

多种肿瘤细胞形成过程中ACSL3都高度表达，ACSL3-LPIAT1(溶血磷脂酰肌醇酰基转移酶1，lysophosphatidylinositol-acyltransferase 1)途径是肺癌前列腺素(prostaglandin)持续合成的必要条件，前列腺素合成升高时会促进肺癌(lung cancer)的形成和加速肺癌的进展[24]。ACSL3的有效抑制剂triacsin C在体内和体外都抑制了肿瘤细胞的生长，且ACSL3过表达可促进肿瘤的形成和生长[25]。

肿瘤种类多样，鉴别肿瘤的类型是肿瘤治疗的关键步骤。在肝细胞癌和胆管癌细胞鉴别诊断过程中ACSL3的表达可帮助区分肝细胞癌与胆管癌，其敏感性为87.2%，特异性为75%[26]。Choi等[27]检测到ACSL3基因的突变有助于鉴别子宫内膜间质肉瘤。故ACSL3对于肿瘤种类鉴别意义重大。

肿瘤的预后判断对于指导临床医生设计治疗方案和提高患者的生存率都具有重要意义。在肺癌、前列腺癌和雌激素受体阴性乳腺癌中均发现ACSL3过表达预示着肿瘤预后不良。在三阴性乳腺癌中 ACSL3活性降低而导致的脂肪酸β氧化(fatty acid β-oxidation，FAO)的改变也可作为三阴性乳腺癌预后的标志[28]。也有研究表明，ACSL3纯合子缺失可促进辅助化疗后乳腺癌患者的远处转移[29, 30]。ACSL3广泛参与不同种类的肿瘤和肿瘤的不同阶段，ACSL3可能是肿瘤诊断和治疗的关键基因(见Fig.2)。

Fig.2 The relationship between acyl CoA long-chain synthetase 3 and related diseases (A) The relationship between ACSL3 and AS. (B) The relationship between ACSL3 and NAFLD. (C) The relationship between ACSL3 and diabetes. (D) The relationship between ACSL3 and lung cancer.→: promote; —|: inhibition;-→change; -/- : knockout

3.5 ACSL3与脊髓灰质炎

脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒(poliovirus，PV)引起的严重危害人类健康的急性传染性疾病。PV是小核糖核酸病毒的一种，其膜复制平台的形成是病毒生命周期中不可或缺的一步。PV感染细胞的普遍现象是增加细胞中长链脂肪酸的摄入。

Nchoutmboube等[31]研究发现，脊髓灰质炎病毒感染细胞摄入长链脂肪酸的量与酰基辅酶A合成酶活性的激活有关。在感染脊髓灰质炎病毒后，细胞整体酰基辅酶A合成酶活性升高，并作用于脂肪酸。在感染细胞中，大量摄入的脂肪酸主要用于高活性的磷脂酰胆碱合成，这反映了膜复制平台的快速形成。ACSL3可调节酰基辅酶A合成酶的活性。当siRNA敲除ACSL3和融合蛋白GFP-ACSL3-HA的过表达均不利于脊髓灰质炎病毒的复制。可能是融合蛋白的GFP和或HA标记特异性干扰了支持病毒感染所需的ACSL3功能。这些研究表明，ACSL3是支持脊髓灰质炎病毒有效复制所必需的蛋白质，是一种新的脊髓灰质炎病毒宿主因子。

4 问题与展望

脂质代谢及其相关机制一直是科研的重心，众多国内外科研人员研究并报道了ACSL3参与脂滴的合成、自噬及铁死亡等众多病理生理过程。虽然大多数情况下ACSL3过表达可能会促进动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝病、肿瘤和脊髓灰质炎等疾病，但随着对ACSL3研究的深入发现，其在糖尿病的发展过程及肿瘤的鉴别中是发挥积极作用的。ACSL3在不同疾病中发挥的作用不同，提示ACSL3在体内有多种代谢途径和功能具有多样性。例如，ACSL3即促进了脂滴的合成又参与了自噬的调节，且这两种生理过程都与动脉粥样硬化密切相关，完善ACSL3在动脉粥样硬化过程中的作用机制，必将对防治动脉粥样硬化贡献新的实验依据。而更深层次的研究将进一步阐明ACSL3在不同疾病过程中的具体作用机制，将为ACSL3相关疾病的防治增加新的靶点。