基于UPLC-Q-TOF-MS技术的独一味成分分析与鉴定

杜少波，张 勐，陈晓文，董志强，谢惠春*

（1.青海师范大学生命科学学院，青海西宁810008；2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海西宁810008）

独一味系唇形科独一味属多年生草本植物独一味［Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo］的干燥根茎或全草，广泛分布于青海、西藏、云南、甘肃等海拔3 000 m 以上的石质高山草甸或强度风化的碎石滩上［1-2］，其干燥后表面呈枯黄色，性甘味苦，归肝经，是青藏高原重要的大宗藏药和常用草药［3］，具有抗菌、抗肿瘤、止血化瘀、镇痛消炎以及增强免疫等功效［4-5］。早在20 世纪80 年代，对独一味成分的研究就已经开展［6］，其中环烯醚萜类化合物、黄酮类化合物、苯乙醇苷类化合物被认为是其主要存在的成分，也是主要发挥药效作用的成分和特征性成分［3，7］。但是目前针对其化学研究主要集中在传统的化学成分分离与鉴定上，具有操作复杂，周期性长等显著缺点［8-9］，而且多数相关文献报道年限久远，缺乏全面性和创新性。

为了进一步阐明独一味药效物质基础，本研究采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术［10-11］对其成分进行了全面的分析与鉴定，进一步完善了其化学成分的构成，为其质量控制及药效物质基础研究提供了参考和科学依据。

1 试验材料

1.1 仪器

Xevo G2-XS QTof 液质联用仪、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱（美国Waters 公司）；Secura513-1CN 精密天平（德国Sartorius公司）；KQ3200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；R-220SE 大型浓缩系统（瑞士Buchi 公司）；Eyela FDU-2110 型冷冻干燥机（日本EYELA 东京理化器械株式会社）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）；5810R 台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf Centrifuge公司）。

1.2 试剂与样品

1.2.1 试剂

甲醇、异丙醇（色谱级LC，德国Merck 公司）；乙腈、甲酸（质谱级LC/MS，德国Merck 公司）；氢氧化钠（ACS 级，ACS reagent≥97%，美国Sigma 公司）；亮氨酸脑啡肽（Standards Kit for Tof G2-S，美国Waters公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；超纯水由Milli-Q 超纯水仪制备；其它试剂均为分析纯。

1.2.2 对照品

咖啡酸（CAS：331-39-5）；芹菜素（CAS：520-36-5）；木犀草素（CAS：491-70-3）；绿原酸（CAS：327-97-9）；马钱苷（CAS：18524-94-2）；山栀苷甲酯（CAS：64421-28-9）；胡麻属苷（CAS：117479-87-5）；木犀草苷（CAS：5373-11-5）；8-O-乙酰山栀苷甲酯（CAS：57420-46-9）；毛蕊花糖苷（CAS：61276-17-3）；异毛蕊花苷（CAS：61303-13-7）；连翘酯苷B（CAS：81525-13-5）；所有对照品纯度均≥98%，购自成都植标化纯生物技术有限公司。

1.2.3 供试样品

独一味样品采自青海省玛沁县（经度100°8′23″，纬度33°24′47″，海拔4 156 m），由青海省药用动植物资源重点实验室主任陈志教授鉴定为独一味。样品进行自然风干，粉碎过筛（50 目筛）分装后，在-20℃冰箱中冷冻保存。

2 方法

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱，程序设置见表1。柱温40℃，体积流量0.3 mL/min，进样量1 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

2.1.2 质谱方法

电喷雾离子源（ESI）在负离子条件下，Continuum 模式，采集MSE数据。校正液为200 pg/μL 亮氨酸脑啡肽，0.5 mmol 甲酸钠。扫描范围m/z50~1 200，扫描时间0.2 s，检测时间20 min。低能量碰撞电压（CE）6 V，高能量碰撞电压为20~60 V；负离子模式的毛细管电压为2.0 kV，锥孔电压为60 V，离子源温度为100℃，辅助喷雾电离与去溶剂气体为高纯度氮气，去溶剂化温度450℃，锥孔气体流量50 L/hr，去溶剂化气体流量600 L/hr。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制

分别取咖啡酸、芹菜素、木犀草素、绿原酸等12种对照品适量置于量瓶中，加甲醇溶解，配置成浓度为0.25 mg/mL 溶液，上机前依据化合物的溶解情况，用适量75%乙腈稀释后，冷冻离心10 min（12 000 r/min，10℃），离心管取出后轻放，取上清液，分别存储到2 mL的透明样品瓶中。

2.2.2 供试样品溶液的配制

准确称取独一味提取物粉末0.1 g，置于具塞玻璃试管，加入6 mL 色谱甲醇浸没，50℃水浴，超声提取1 h，摇匀后静置5 min。取提取液上清200 μL，HLB 固相萃取柱吸附，依次用0.5 mL 纯甲醇和0.5 mL75%乙腈洗脱，收集洗脱液混合，标记为DYW，经冷冻离心10 min 后（12 000 r/min，10℃），取上清装入2 mL透明样品瓶，即得供试样品溶液。

2.3 数据采集与处理

数据工作站为Masslynx 4.1 软件，通过提取MS质谱图和相关碎片信息，基于其内置的质谱分析平台，包括ChemSpider 在线数据库（PubMed、Pub-Chem、MassBank 等）和中药数据库（TCM Chiese［UNIFI1.7］），结合文献报道和Scifinder 数据进行成分判别分析。

3 结果

检测独一味供试样品，得到独一味负离子模式下总离子色谱图（Total ions chromatograph，TIC）如图1 所示。咖啡酸、芹菜素、木犀草素、绿原酸等12 个对照品负离子模式下总离子色谱图如图2所示。根据精确质荷比，二级碎片离子信息，结合对照品和文献信息，共鉴定推测出65 个化合物，其中23 个属于苯乙醇苷类化合物，17 个属于环烯醚萜类化合物，15 个属于黄酮类化合物，10 个属于其他种类化合物，12 个化合物经对照品比对确认；其中肉苁蓉苷D、京尼平苷、5-甲基帚木糖苷、乌苏酸等22 个化合物首次在该属得到鉴定，结果如表2所示，22个首次鉴定化合物结构式如图3所示。

图3 22个首次在该属鉴定的化合物结构式Fig.3 Structural formulas of 22 compounds identified for the first time in this genus

表2 独一味的UPLC-Q-TOF-MS质谱数据Tab.2 The mass spectrometry data of L.rotata

图1 独一味负离子模式TIC图Fig.1 The TIC of L.rotata under negative ion mode

图2 对照品负离子模式TIC图Fig.2 The TIC of standards under negative ion mode

续表

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3.1 环烯醚萜类化合物

环烯醚萜类化合物的基本母核是环烯醚萜醇，具有环状烯醚及半缩醛羟基。半缩醛羟基性质活泼，故该类化合物多以苷类存在［12］，其在高能量状态下，容易脱去母环上的功能基团，丢失中性H2O、CO2、CH3OH、CH3COOH 和糖基部分［13］。以化合物23 为例，其准离子峰为m/z493［M+COOH］-，推断其分子式为C19H28O12，在裂解过程中，首先脱去一分子葡萄糖形成m/z285［M-H-GLc］-的特征性碎片离子，再脱去一分子乙酸和一分子水形成m/z207［M-H-GLc-CH3COOH-H2O］-碎片离子，进一步脱去一分子甲醇形成m/z175［M-H-GLc-CH3COOH-H2O-CH3OH］-的特征碎片离子，通过查阅文献［14］和与对照品比对，确定化合物23 为8-O-乙酰山栀苷甲酯，其二级质谱图和裂解途径如图4和图5 所示。

图4 8-O-乙酰山栀苷甲酯的二级质谱图Fig.4 MS spectrum of 8-O-Acetyl shanzhiside methylester

图5 8-O-乙酰山栀苷甲酯的裂解途径Fig.5 The cleavage pathway of 8-O-Acetyl shanzhiside methylester

3.2 苯乙醇苷类化合物

苯乙醇苷类化合物通常是由苯乙醇苷元、糖、咖啡酰基组成的，所以在质谱的鉴定中经常会存在［M-H-Caffeoy］-和［M-H-GLc］-的特征性碎片离子［15］。以化合物30为例，其准离子峰为m/z623［MH］-，推断其分子式为C29H36O15，在裂解过程中，首先脱去一分子咖啡酰基形成m/z461［M-H-Caffeoy］-的特征性碎片离子，再通过脱一分子鼠李糖形成m/z315［M-H-caffeoy-C6H10O4］-的特征性碎片离子，再脱去一分子糖基和-分子水形成m/z135［M-HCaffeoy-C6H10O4-GLc-H2O］-的特征性碎片离子，通过查阅文献［16］和与对照品比对，确定化合物30为毛蕊花糖苷，其二级质谱图和裂解途径如图6 和图7所示。

图6 毛蕊花糖苷的二级质谱图Fig.6 MS spectrum of Acteoside

图7 毛蕊花糖苷的裂解途径Fig.7 The cleavage pathway of Acteoside

3.3 黄酮类化合物

黄酮类化合物主要由苷元和糖苷组成，发生裂解时主要脱去其糖基部分形成苷元结构，然后苷元离子进一步发生Retro Diels-Alder（RDA）裂解反应或者脱羰基反应［17］。以化合物29为例，其准离子峰为m/z447［M-H］-，推断分子式为C21H20O11，在裂解过程中，首先脱去糖基部分形成m/z285［M-H-Glc］-的特征碎片离子，进一步发生RAD 裂解反应产生m/z151［C7H5O4］-的特征碎片离子，再进一步脱去一分子水形成m/z133［M-H-Glc-1，3A＋-H2O］-的特征性离子，通过查阅文献［18］和与对照品比对，确定化合物29 为木犀草素-7-O-葡萄糖苷，其二级质谱图和裂解途径如图8和图9所示。

图8 木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷的二级质谱图Fig.8 MS spectrum of Luteolin-7-O-β-D-glucoside

图9 木犀草素-7-O-葡萄糖苷的裂解途径Fig.9 The cleavage pathway of Luteolin-7-O-β-D-glucoside

4 讨论与结论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技术对独一味化学成分进行了全面系统的分析，整体上明确了独一味化学成分构成，为独一味药理药效研究提供了新的角度和方向，对深入挖掘分析其药效物质和阐明作用机制奠定了坚实的基础。

4.1 基于UPLC-Q-TOF-MS 技术对独一味化学成分的分析鉴定

研究表明，中药材的质量及药效作用主要是由其化学成分所决定的，而化学成分的构成也揭示了中药材药效物质的基础，两者是相辅相成，密不可分的［19］。本研究采用灵敏度高、选择性高、稳定性高、分辨率高、扫描范围广的UPLC-Q-TOF-MS 技术鉴定出独一味成分的构成主要包含环烯醚萜类、苯乙醇苷类和黄酮类化合物，这与现有的研究结果一致［20］。本研究从3 种类型的化合物中首次鉴定了苁蓉苷D、京尼平苷、5-甲基帚木糖苷、乌苏酸等22 个化合物，其中新鉴定的化合物中属于苯乙醇苷类化合物的最多。除了3种典型的化合物类型外，本研究还鉴定出羟基积雪草酸、6-姜酚、阿江榄仁酸、乌苏酸、咖啡酸等10个其他类型的化合物，进一步丰富了独一味化学成分的构成。

4.2 独一味主要有效成分研究与探讨

在过往对独一味药理药效作用的研究报道中发现，独一味中环烯醚萜类化合物具有显著的抗炎镇痛和止血功效［21-23］，它可以通过抑制组织胺和Prostaglandin（PG）等相关炎症因子的合成与释放，从而达到抗炎镇痛的作用［24］，也可以通过提高小鼠血浆中纤维蛋白的含量，缩短凝血酶的时间，达到止血的效果［25］，其中的8-O-乙酰山栀苷甲酯更是被认为是环烯醚萜类化合物主要发挥药效作用的物质［26-28］，这可能与其在独一味中的含量较高有关，试验结果也证明了8-O-乙酰山栀苷甲酯确实在质谱中具有较高响应值。除此之外，试验中还发现环烯醚萜类化合物中的马钱苷酸和苯乙醇苷类化合物中的连翘酯苷B、毛蕊花糖苷也都具有较高的响应值，此前有研究表明它们具有抗氧化、抗炎杀菌、调节细胞凋亡等多种生理活性［29-31］，说明它们可能和8-O-乙酰山栀苷甲酯一样是独一味中主要发挥药效作用的物质，这些都有待进一步的研究。综上所述，在后期研究中可以针对3 种典型化合物类型分别进行成分提取，比较它们之间的药理药效差异情况；也可以通过对单体化合物进行分离提取鉴定，再结合药理实验，进一步阐述独一味药理药效机制。