不同产地栽培天麻的质量研究

徐 广，李品明，谭秋生，杨 毅，邓才富*，杨永东，罗 舜

（1.重庆市药物种植研究所中药材生产质量控制研究中心，重庆南川408435；2.重庆市道地药材工程技术中心，重庆 南川408435）

天麻为兰科植物天麻［Gastrodia elataBl.］的干燥块茎，自古为名贵中药材之一，《中国药典》［1］记载：性甘、平，归肝经，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效。《神农本草经》记载天麻具有“治风”和“补益”两大功效。《本草纲目》记载天麻“补益上药，天麻为第一，久服益气力，能长阴肥健，增长寿命。消臃肿，下肢满，寒疝下血”。现代药理学研究表明，天麻具有多种药理活性［2-4］，付亚轩等［5］通过对天麻抗抑郁作用药效物质基础及其机制分析，发现天麻具有良好的抗抑郁作用；张志龙等［6］研究分析了天麻对中枢神经系统的作用，表明在中枢神经系统方面的疾病具有很好疗效；同时天麻还能防治精神病［7］。除传统用药之外，天麻在民间一直有不同形式的食用习惯。在2020 年1 月2 日，国家卫健委、国家市场监督管理总局发布文件，确定天麻为药食同源物质种类。由于野生资源的日渐减少，各地主要以人工栽培为主［8-9］。项目团队在种质筛选和挖掘过程中对不同产地的天麻商品开展了相关质量分析，以期为天麻在食、药研究和产品开发方面提供参考。

1 材料与仪器

l.1 样品

采集的样品详细信息如表1所示。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

所有样品均为项目团队于2 月下旬至3 月中旬在九个天麻种植基地的天麻栽培品中采收，经重庆市药物种植研究所邓才富研究员鉴定其基源均为兰科植物天麻G.elataBl.。每组样品选取2 500 g新鲜天麻的混合样快速洗净泥沙后，用YEN 50液体真空浓缩煎药机蒸汽蒸制20 min，装盘放入50℃烘箱干燥10 h 后取出切厚片2~4 mm，继续50℃烘干，粉碎过筛放冰箱备用。

1.2 试剂及仪器

乙醇（分析纯，重庆川东化工，批号20160601）；乙腈（色谱纯，成都市科龙化工试剂厂，批号2013120101）；水（为现制超纯水）；天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110807-201608、111970-201501）。

高效液相色谱仪（LC-20AT，岛津）；电子天平（METTLER AL104，梅特勒-托利多）；电子天平（CPA225D，赛多利斯科学仪器有限公司）；Molecular标准智能型纯水机（上海摩勒科学仪器有限公司）；数控超声波清洗器（KQ-1000DE，昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG，上海龙跃仪器有限公司）；箱式电阻炉（SX2-8-10，上海龙跃仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-8，上海汗诺仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 总灰分和浸出物测定方法

按《中国药典》（2020 年版）“天麻”标准项下规定测定总灰分和浸出物含量。

2.2 指标成分测定方法

2.2.1 色谱条件

按《中国药典》（2020 年版）“天麻”标准项下“含量测定”规定测定，乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）为流动相；检测波长为220 nm，理论板数按天麻素峰计算应不低于5 000。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取天麻的对照品天麻素和对羟基苯甲醇适量，用乙腈-水（3∶97）混合溶液配置成每l mL各含天麻素50 μg、对羟基苯甲醇25 μg 的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备

取天麻样品（过三号筛）约2 g，精密称量，置250 mL 具塞锥形瓶中，加入稀乙醇50 mL，密塞，称重，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称重，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液10 mL，浓缩至近干无醇味，残渣加乙腈-水（3∶97）混合溶液溶解，定容于25 mL 量瓶中，摇匀，过滤，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 线性关系试验

取2.2.2 项下对照品液稀释1、2、4、8、16、32 倍，按2.2.1 项下的色谱条件进样，以峰面积为Y 值，进样量为X 值进行线性回归，得标准曲线：天麻素：Y=320 878X-339 071，R²=0.950 7；对羟基苯甲醇：Y=1 107 752.9X-1 168 210.3，R²=0.951 1。

2.2.5 方法学考察

按照《中国药典》方法学考察了仪器精密度试验、重复性试验和稳定性试验，以天麻素和对羟基苯甲醇色谱峰的相对保留时间和峰面积为参数，RSD均小于3%。

2.3 数据处理

应用Excel 2010，Origin 8 等软件进行数据分析和相关图表绘制，以中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相关性分析，提取共有色谱峰面积导入SIMCA 14.1 进行系统聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交校正的偏最小二乘分析（Orthogonal partral least squares，OPLS）。

2.4 结果与分析

2.4.1 不同产地天麻质量分析

不同产地天麻样品的质量分析数据如表2 所示：分析9个不同产地人工栽培天麻的质量，结果表明，总灰分最低值为2.01%，最高值为3.24%，远低于药典规定的不超过4.5%标准，表明各地人工栽培环节对灰分的影响较小；浸出物最低值为20.33%，最高值为33.17%，其最低值都大大高于药典规定的不低于15.0%的含量标准。药典规定的双指标（天麻素和对羟基苯甲醇）的含量不低于0.25%，实验样品的双指标成分含量之和均高于该规定。研究结果表明试验天麻样品品质好，但有差异性。

表2 不同产地天麻样品质量分析Tab.2 Quality analysis from different origins of G.elata Bl.

为了比较数据间的差异性，对表2 中指标成分数据进行了变异系数分析，从9 个不同产地样品的总灰分和浸出物变异系数都较小，表明产地间这两个指标的差异较小。9 个不同产地样品的指标成分天麻素和对羟基苯甲醇的变异系数分别是浸出物变异系数的2.39 倍和2.97 倍，表明就检测指标而言，不同产地人工栽培天麻的品质差异较大。

2.4.2 不同产地天麻样品相似度分析

将9 批天麻样品的HPLC 图谱以*.cdf 格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A 版软件，得到图谱叠加图谱，如图1 所示。以S1 为图谱作为参照图谱，采用中位数法、多点校正、自动匹配产生8 个共有峰。同时采用对照品对其2 个共有峰进行了指认，峰7 为天麻素，峰8 为对羟基苯甲醇，如图2 所示。计算不同产地天麻样品之间的HPLC图谱相似度，绘制相似度热图，如图3所示。结果表明，不同产地的天麻相似度系数0.336~0.981，表明不同产地的人工种植天麻样品的内在质量差异较大。

图1 不同产地天麻样品HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC Fingerprints of G.elata Bl.

图2 天麻指纹图谱（A）与对照品HPLC图（B）Fig.2 Reference fingerprint（A）of G.elata Bl.and HPLC chromatogram（B）of reference substances

图3 不同产地天麻样品HPLC相似度热图Fig.3 Hot map of fingerprint similarty from G.elata Bl.

2.4.3 化学模式质量特征分析

2.4.3.1 HCA分析

将不同产地天麻样品的8个共有峰的峰面积数据导入SICMA 14.1软件，对数据进行HCA分析。通过HCA 分析得聚类树状图，如图4 所示，在欧式距离小于5 时，聚为四类，S2、S5、S8 和S9 聚为一类，S1和S6 聚为一类，S3 和S7 聚为一类，S4 单独聚为一类。在欧式距离小于12 时，聚为两类，S1 和S6 聚为一类，其他为一类。

图4 不同产地天麻聚类分析树状图Fig.4 Cluster analysis from different origins of G.elata Bl.

2.4.3.2 PCA分析

为了更直观的阐明不同产地栽培天麻质量特征的差异性，利用SICMA 14.1软件对其共有峰数据进行PCA 分析，其得分图可以提供可视化的天麻分类图。模型参数R2X 为0.777，Q2为0.21，表明模型可靠，预测能力强，结果如图5所示。

由图5 可知，不同产地天麻样品区分良好，S2、S5、S8 和S9 聚为一类，S1 和S6 聚为一类，S3 和S7 聚为一类，S4 单独聚为一类。表明9 组不同产地天麻的质量差异性大，同时也表明聚类分析的可靠性。

图5 PCA得分图Fig.5 PCA score scatter plot

2.4.3.3 OPLS分析

为了更好地解释样品间差异，探寻样品间贡献率大的特征峰，对其共有峰峰面积进行OPLS 分析得到散点图（图6）、VIP值图（图7）和载荷散点图（图8）。结果显示，模型参数R2X = 0.818，R2Y = 0.322，Q2= 0.37。表明模拟拟合程度和预测能力较好，该模型能作为天麻质量特征的HPLC 模式识别方法。由图6可知，样品的数据点均落在95%置信区间内，说明各个天麻样品的化学成分相似，但分散区域较大，说明各个天麻样品在整体质量上存在较大的差异。由图7筛选出能引起不同天麻样品成分差异的主要标记性成分（VIP ＞1 且误差条范围在X ＞0 以上的成分），从图7 中，满足VIP 值要求的成分有3个，强弱依次为峰7、峰5和峰8，其中峰7为天麻素，峰8 为对羟基苯甲醇。同时在图8 中也显示这三个化合物的变量离原点的距离较远，说明这三个成分是不同天麻间差异性的主要标记物。

图6 OPLS得分图Fig.6 OPLS score scatter plot

图7 VIP值图Fig.7 VIP score

图8 载荷散点图Fig.8 Loading scatter plot

3 讨论

本次样品采集依托于种质资源收集引进，在天麻产地上样本量偏小，且只在一个地方采集了一个基地的混合样品，试验的总体丰富度上有所欠缺。但从数据结果来看，天麻素和对羟基苯甲醇含量变异系数较大，表明以指标成分考察的话，不同地区之间天麻在具体内含物之间差异较大。通过指纹图谱相似度和化学模式分析，不同产地的天麻相似度系数0.336~0.981之间，聚为两大类，三小类；共有峰的峰7、峰5 和峰8 为不同样品间成分差异的主要标记物。基于指纹图谱相似度和化学模式分析能为天麻的产地识别提供一定程度的技术支持。

中药材质量受地域环境、种植技术和管理水平的影响较大，随着种植技术的突破和大健康产业的快速发展，天麻的种植区域不断扩大，包括了全国大部分地区。本研究中样品来源涵盖了西南、西北、华中几大区域的部分传统天麻产区。从分析结果来看，同处西南地区的南川、江油、青川和彝良四个产区，天麻素和对羟基苯甲醇的总含量整体上较高，同时在四个产区收集的天麻样品的生长海拔均在1 000 m 以上，海拔高度是否影响了天麻内含物的有效积累［10］，项目团队将在种质研究的基础上开展不同海拔梯度条件下人工栽培天麻的最适区域栽培研究，为优质天麻的高效栽培提供技术支撑。