基于生物信息学探讨肥胖与不孕症的关系

李丹丹 王东梅 曹卫平 翟凤婷

不孕症(infertility)是一种由多种病因导致的生育障碍状态，女性无避孕性生活至少12个月而未孕称为不孕症[1]，其发病趋势逐年上升。世界卫生组织预测，21世纪不孕症将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病[2]。肥胖作为常见的慢性代谢性疾病之一，“正像流行性疾病一样蔓延、吞噬整个世界”。肥胖(obesity)是体内脂肪过度蓄积和(或)分布异常，往往伴有体重增加[3]。近年来，中国肥胖率也迅速增长。有研究发现，肥胖与多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)存在某种影响，可降低妊娠率，增高流产率，最终改变妊娠结局[4]。

中医古籍中也有肥胖与不孕的相关记载。金元·朱震亨《丹溪心法》言：“若是肥盛妇人，禀受甚厚，恣于酒食之人，经水不调，不能成胎，谓之躯脂满溢，闭塞子宫”。明·万全《万氏妇人科》云：“惟彼肥硕者，膏脂充满，玄室之户不开，挟痰者痰涎壅滞，血海之波不流……及为浊、为带、为经闭、为无子之病”。清·傅山《傅青主女科》载：“妇人有身体肥胖，痰涎甚多，不能受孕者……湿盛者多肥胖，肥胖者多气虚，气虚者多痰涎……日积月累，则胞胎竟变为汪洋之水窟矣。且肥胖之妇，内肉必满，遮隔子宫，不能受精，此必然之势也”。

因而肥胖与不孕症间有着密切的关系，本文利用生物信息技术从微观角度探讨两疾病间的关系，有助于更好地理解疾病发生、发展的相关机制，同时也为临床进一步探究提供了思路。

资料与方法

一、肥胖和不孕症的疾病靶点筛选与核心靶点预测

在GeneCards、TTD、OMIM数据库中搜索关键词：“infertility”、“obesity”，结合Uniprot数据库得到疾病相关靶点，去重、映射得到关键靶点，通过STRING数据库构建关键靶点的PPI网络图，将图用Cytoscape3.7.2进行分析，根据节点度(Degree)值≥16筛选核心作用靶点。

二、生物通路及富集分析

利用DAVID数据库对核心靶点进行Gene Ontology(GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析，筛选出与研究疾病相关的前10个GO条目与KEGG条目，依据Omicshare云平台制作高级气泡图，通过富集结果分析两种疾病间的关系。

结 果

经过搜索、标准化处理、查重整合后共选出不孕症相关靶点312个，肥胖相关靶点483个，包括关键靶点61个，见韦恩图(见图1)。构建出关键靶点的PPI网络图(见图2)，靶点之间有384条相互作用关系，Degree值范围1到32，筛选到核心靶点17个(见图3)，核心靶点即是研究不孕症与肥胖联系的重要节点。利用DAVID数据库进行分析，P值代表富集的显著性，P<0.05代表富集结果显著[5]，FDR为矫正后P值(<0.05)，共筛选出33项GO条目及13条KEGG通路，以P值升序排列，分别筛选出符合条件的10个GO、KEGG条目，并制作气泡图(见图4、图5)。生物过程及通路下所含靶点分别见表1、表2。

图1 不孕症与肥胖的映射关键靶点韦恩图

图2 关键靶点的PPI互相作用网络图

图3 核心靶点网络图(核心靶点大小为Degree值大小)

图4 GO富集气泡图

图5 KEGG富集气泡图

表1 GO富集分析(与疾病相关的前10条)

表2 KEGG通路(与疾病相关的前10条)

讨 论

近年来，肥胖对生育力的影响逐渐受到关注。在青少年和年轻女性中，肥胖的发病年龄和月经异常的发病年龄显著相关[6]。有研究表明，体重指数(body mass index，BMI)是评价育龄妇女生育能力的一个重要指标[7]，接受体外受精(in vitro fertilization，IVF)/卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的高BMI组患者早期流产率显著高于正常体重组，提示过度肥胖对IVF/ICSI结局有一定的负面影响[8]。因而肥胖与月经周期不规律、生育能力降低、流产风险增加之间存在显著关联。本文应用生物信息学技术在挖掘两疾病的相关基因并对其分析，得到同时作用于两疾病的核心靶点，胰岛素(insulina，INS)、促阿片-黑素细胞皮质素原(pro-opiomelanocortin，POMC)、胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1，IGF1)、瘦素(leptin，LEP)、白细胞介素6(interleukin 6，IL6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等。GO分析从生物学过程、细胞学组分、分子生物学功能三个功能大类，对一个基因的功能进行多方面的限定和描述，发现两疾病主要涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联的正调控、激素的活性、葡萄糖稳态、胰岛素受体结合、脂质储存的负调控等。分析KEGG通路结果，发现不孕与肥胖的核心靶点主要通过作用于脂肪细胞因子信号通路、Janu激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)信号通路、胰岛素抵抗、腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase，AMPK)信号通路、卵巢类固醇生成、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路。

LEP和脂联素(adiponectin，APN)是脂肪细胞分泌的两大重要的细胞因子[9]。其中LEP可以调节代谢、内分泌功能、免疫功能等，可以抑制食欲，促进能量消耗，影响糖代谢。LEP与瘦素受体(leptin receptor，LEPR)通过偶联和激活酪氨酸激酶(Janus kinases，JAK)2经多种信号转导途径作用于POMC。其信号转导通路有JAK/STAT信号转导通路、MAPK/细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号转导通路、胰岛素受体底物(IRS)/PI3K信号转导通路3种途径[10-13]。JAK-STAT信号通路与PI3K/AKT/mTOR信号通路协同发挥作用[14]。炎症因子刺激可激活JAK-STAT，进而影响巨噬细胞的分化和炎症因子的表达[15]。该信号通路紊乱，则会引起一些相关的免疫疾病，如甲状腺疾病、糖尿病[16]。LEP能减弱肝细胞系中酪氨酸胰岛素诱导的信号，拮抗部分INS功能，从而产生胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)[17]。IR是很多代谢性疾病的一个重要特征，糖尿病所导致的高雄激素血症及IR在PCOS的发病中起着早期和决定性的作用[18]。中国PCOS患者合并肥胖的患病率为34.1%～43.3%[19]。肥胖和IR会破坏窦卵泡发育，从而导致慢性无排卵[20]，腹部肥胖影响尤其显著，其机制包括INS介导的卵巢类固醇生成过度刺激和性激素结合球蛋白血浓度降低[21]。肥胖人群有高LEP，通过干扰促性腺激素的刺激作用，抑制黄体化的颗粒细胞产生雌激素和孕激素[22]。另外，LEP可调节促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)的分泌，慢性过度肥胖会产生瘦素抵抗，减少GnRH分泌，降低生育能力[23]。APN可以增强INS作用，影响糖脂代谢，也有抗动脉粥样硬化、炎性反应等作用[24]，其水平在肥胖人群中显著降低，与肥胖症、脂质代谢异常、糖尿病、心血管疾病明显相关[25]。有研究证明，缺乏APN会导致减弱其介导的INS信号转导，从而出现IR[26]。APN通过激活AMPK信号通路可抑制GnRH和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的释放，调节下丘脑-垂体-卵巢(HPO)轴，又导致子宫内膜容受性降低，影响生殖代谢功能[27-29]。AMPK信号通路是调节细胞能量状态的中心环节，AMPK通过LEP、ANP等因子在增加葡萄糖摄取、增强INS敏感性等方面发挥重要作用。多种脂源性细胞因子表达异常与IR密切相关，继而影响2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)的发生发展[30]。

脂肪组织还能分泌炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6等[30]。TNF-α可通过抑制INS信号转导、抑制葡萄糖的转运和摄取、降低INS受体数目及其与INS的亲合力、加速脂肪分解等导致全身性IR[25]。IL-6也可通过介导免疫炎性反应参与其中。肥胖人群体内长期存在代谢性炎症[31]，此状态不仅影响了卵母细胞正常的生长、成熟，导致卵母细胞质量下降，引起胚胎发育不良[32]。还会通过加重子宫内膜炎症影响子宫内膜蜕膜化而降低其容受性，增加流产率[33]。在免疫反应中，细胞因子如TNF-α等可诱导巨噬细胞表达，调控其功能[34]。巨噬细胞在调控母体免疫状况的过程中发挥着重要作用，通过调节母体免疫耐受来影响胚胎能否免受免疫打击而流产[35-38]。细胞自噬过程是溶酶体对自身结构的吞噬降解，mTOR是调节细胞生长和增殖的重要因子，是自噬启动阶段的关键调节因子，可抑制自噬发生，主要靶点mTOR相关靶点包括TOR复合体1和Ⅰ型PI3K，因此巨噬细胞自噬的调控，其可能的信号通路为PI3K/Akt/mTOR通路[35，39-40]。

多个研究也表明LEP等多个脂源性细胞因子通过非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)信号通路引起代谢综合征(metabolic syndrome，MS)，与IR关系密切。

本文依托生物信息技术，探究肥胖与不孕症两疾病之间的关系，两者间发生发展与机体内分泌改变关系密切，脂肪组织和生殖系统之间的内分泌通讯是双向的，功能性脂肪组织能够调节生殖健康[41]。肥胖可在不同水平影响卵母细胞成熟、胚胎发育和着床、胎盘和子宫环境[42]。此类基因靶点的信息整合依赖于生物信息技术、基因数据库的准确性，具体作用机制仍需进一步试验研究的验证。