高灵敏过氧亚硝酸根双光子荧光探针的构建与应用

王旭梅，高明昱，孙 琦，宋新建，†

1. 湖北民族大学生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北恩施445000；2. 湖北民族大学化学与环境工程学院，湖北恩施445000

0 引 言

过氧亚硝酸根（peroxynitrite，ONOO-）是一种细胞内源性活性氧物种（reactive oxygen species，ROS），由生物系统中超氧阴离子自由基（O2•-）和一氧化氮（NO）快速反应形成，具有抗菌活性和信号传导作用[1]。体内ONOO-浓度过高时，会氧化破坏DNA、蛋白质和脂质的结构，引起炎症反应导致细胞死亡。ONOO-还可以硝化酪氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸，从而影响细胞的正常生长[2～4]。因此，揭示细胞内ONOO-的分布与浓度波动对于了解ONOO-在不同生理或病理过程中的作用至关重要。

双光子激光共聚焦成像是一种重要的荧光成像工具[5～7]，其较长的激发波长可以减少生物背景荧光，提高信噪比[8]；对生物样品的损伤较小，适于生物样品的长时间成像观测；其焦点激发的方式可避免焦点以外的光漂白，从而提高空间分辨率[9]；其近红外激发可实现深度组织成像[10～12]。这些优势都为实时、原位检测生物体中ONOO-的分布与水平变化提供了支持。然而，目前用于检测ONOO-的大多数双光子荧光探针缺乏大的双光子荧光活性截面（δΦ），很难利用双光子激光共聚焦成像技术实现ONOO-的荧光成像分析。

6-羟基-2,3,4,4a-四氢-1H-氧杂蒽-1-酮（GCTPOC）是Yuan 课题组[13]2013 年合成的一种双光子荧光团。与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）及其刚性类似物相比，GCTPOC 表现出如下优势：1) 从化学结构上看，GCTPOC 使用氧桥将荧光团单元锁定成刚性平面结构，类似于GFP发色团的Z-异构体，以防止芳基-烯烃的自由旋转和双键的E/Z 异构化；2) GFP 生色团咪唑啉酮环中的两个氮原子被替换为碳原子，发色团中的酰胺官能团在GCTPOC 中转变成羰基，具有更强的吸电子能力。可见，GCTPOC 具有更有效的推-拉结构，因而具有更大的双光子荧光活性截面。

为此，本工作以GCTPOC 为双光子荧光团、以1-甲基吲哚啉-2,3-二酮为ONOO-的识别基团，设计并合成了一种用于检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针GCT-ONOO（图1），可特异性识别并检测细胞内ONOO-。该探针对ONOO-具有较短的反应时间（35 min），可应用于监测细胞外源性和内源性ONOO-含量的变化，并可实现细胞炎症过程中对ONOO-的高灵敏成像分析。

图1 GCT-ONOO 探针对细胞内ONOO-的响应机理Fig.1 Response mechanism of GCT-ONOO probe to intracellular ONOO-

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

试剂：SIN-1（5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-噁二唑盐酸盐）购自Cayman Chemical 公司；DMEM细胞培养基购自Gibco 公司；合成及细胞实验使用药品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所有溶剂均购自上海国药集团；所有试剂均为分析纯或更高纯级，使用前未经进一步纯化；实验所需溶液均使用超纯水配制。

仪器：UV-2550 型紫外-可见分光光度计（UVVis，Shimadzu 公司），RF-6000 型荧光分光光度计（Shimadzu 公司），LSM780 NLO 型双光子激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss 公司），6230 TOF 型电喷雾-高分辨时间质谱仪（ESI-TOF，Agilent 公司），Ascend 400 型核磁共振仪（Bruker 公司），Multiskan FC 型酶标仪（ThermoFisher Scientific 公司）。

1.2 探针GCT-ONOO 的合成

GCTPOC 和化合物1 分别根据文献[14]和[15]方法合成。

GCT-ONOO 的合成路线如图2 所示。取300 mg GCTPOC（1.39 mmol）、525 mg 5-溴甲基-1-甲基吲哚啉-2,3-二酮（化合物1）（2.08 mmol）、60 mg NaOH（1.39 mmol）和20 mL 无水乙腈于50 mL圆底烧瓶中，室温条件下搅拌反应8 h，采用薄层色谱法（TLC）监测反应过程。待反应完全后，用二氯甲烷萃取，再经柱层析分离（石油醚/乙酸乙酯体积比1∶1）得到橙色固体，即为GCT-ONOO，产率33.2%。产物的磁共振氢谱（1H NMR，400 MHz,DMSO-d6）化学位移值δ：7.75(d,J=8.1 Hz,1H),7.61(s,1H),7.34(d,J=8.6 Hz,2H),7.16(d,J=8.1 Hz, 1H), 6.71～6.55(m, 2H), 5.11(s, 2H), 5.03～4.94(m,1H),3.14(s,3H),2.40～2.35(m,2H),1.92(t,J=13.6 Hz,2H),1.67(t,J=9.7 Hz,1H),1.23(s,1H)；磁共振碳谱（13C NMR，100 MHz,DMSO-d6）δ：196.68, 183.72, 161.83, 158.77, 157.44,151.54,138.16,132.05,131.71,130.71,128.19,125.42,117.94,115.83,111.05,109.99,102.43,75.01,69.01,38.69,29.46,26.56,17.80；高分辨质谱（HR-MS，ESI-TOF）数据：C23H20NO5+[M+H]+理论值390.134 1；实验值390.135 6。

图2 GCT-ONOO 的合成路线Fig.2 Synthetic route of probe GCT-ONOO

1.3 探针GCT-ONOO 的性能测试

1.3.1 水溶性

配制不同浓度（0.25、5、10、15、20 和25 μmol/L）的GCT-ONOO 溶液，分别与300 μmol/L ONOO-（由供体SIN-1 产生）在37 ℃、170 r/min 条件下反应35 min，然后测试体系的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱，观测体系在385 nm 处吸光度的变化，考察GCT-ONOO 的水溶性，并绘制标准曲线。

1.3.2 双光子荧光活性截面

采用双光子诱导荧光法测定GCT-ONOO 于反应前后的双光子吸收截面[16]。

首先，以10 μmol/L 罗丹明B 乙醇溶液为参比溶液，测得探针GCT-ONOO 及GCTPOC 在甲醇溶液中的荧光量子产率Φs。计算公式如下

其中，A代表最大吸收波长的吸光度（A≤0.05）；Φ代表量子产率，n代表溶剂的折射率；F代表利用最大吸收波长激发后的荧光光谱积分面积；下标s、r分别代表待测样品和参比溶液。此处，Φr为罗丹明B 溶液的量子产率（0.71）。

以罗丹明6G 的甲醇溶液（5 μmol/L）为参比溶液，测定GCT-ONOO 在甲醇溶液中反应前后的双光子吸收截面δ（激发波长：760～900 nm），再通过δΦ计算双光子荧光活性截面。双光子吸收截面δ的计算公式如下：

其中，S为双光子荧光光谱积分面积，c为溶液浓度；δr为罗丹明6G 溶液的双光子吸收截面（70 GM，1 GM=1×10-50cm4·s·photons-1·molecule-1）。

1.3.3 光物理性质

配 制 含10 μmol/L GCT-ONOO，SIN-1 分 别为0、80 μmol/L 的磷酸盐（PBS）缓冲液（pH 7.4，含10% DMSO（二甲基亚砜）），于37 ℃、170 r/min 恒温振荡反应35 min，检测两种反应液的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，考察GCT-ONOO 的光物理性质。

1.3.4 荧光发射光谱

配 制 含10 μmol/L GCT-ONOO、SIN-1 分 别为0、0.5、2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L 的 PBS 缓冲液（pH 7.4，含 10%DMSO），于37 ℃、170 r/min 恒温振荡反应35 min。在激发波长为400 nm、激发和发射狭缝宽度均为5 nm 条件下，扫描体系的荧光发射光谱。

1.3.5 时间依赖性

准确配制浓度为10 μmol/L 的GCT-ONOO 检测液（pH 7.4，含10% DMSO），测试该溶液分别与0、30、60 μmol/L SIN-1 反应0、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min 时的荧光发射光谱，并以每个时间点相应的荧光强度对时间作图。

1.3.6 pH 稳定性

配制含10 μmol/L GCT-ONOO 的检测液，在不同pH 值的PBS 缓冲液（pH 值分别为5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、8.0、8.4，含10% DMSO）中，分别与0、60 μmol/L SIN-1 溶液于37 ℃、170 r/min 恒温振荡反应35 min，测试体系的荧光发射光谱，并以荧光强度对pH 值作图。

1.3.7 选择性

向10 μmol/L 的GCT-ONOO 溶 液 中，分 别 加入生物分子（1.0 mmol/L 同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys））、活性氧（100 μmol/L 过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2•-）和次氯酸（HClO））、活性氮（100 μmol/L 一氧化氮（NO）、亚硝酸根离子（NO2-））、活性硫（H2S）、金属离子（20 μmol/L Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+）和ONOO-（60 μmol/L）的PBS 缓 冲 液（10 mmol/L, pH 7.4，含10% DMSO），于37 ℃、200 r/min 恒温振荡反应35 min，测试体系的荧光发射光谱。

1.3.8 探针GCT-ONOO 的检出限

GCT-ONOO 对ONOO-的检出限（LOD）根据LOD=3σ/k计算。其中，σ表 示11 组GCT-ONOO(10 μmol/L)溶液在520 nm 处的荧光强度标准偏差，k表示GCT-ONOO 在线性范围内的斜率。

1.4 探针GCT-ONOO 的细胞实验

1.4.1 细胞培养

将处于对数生长期的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12 细胞，购自武汉尚恩生物技术有限公司，细胞数大于5×105cells/mL）置于含1%青霉素、1%链霉素和10%胎牛血清的DMEM 培养液中，于37 °C培养箱（5% CO2、95%空气）中培养。成像前一天将细胞转移至玻底培养皿（直径35 mm）中使其贴壁生长到合适密度。在与药物或刺激物共同孵育前，先用37 °C 预热过的PBS 缓冲溶液将细胞清洗两次，除去液体，置于含有药物或刺激物的新鲜培养基中继续孵育。细胞成像前将PC12 细胞用PBS缓冲液清洗两次，成像时双光子激发波长为860 nm，荧光收集范围为480～580 nm（绿色通道）。

1.4.2 细胞毒性实验

采用MTT（噻唑蓝）法测定GCT-ONOO 的细胞毒性。将PC12 细胞接种于96 孔板中，将0、5、10、20、30 μmol/L GCT-ONOO 分 别 加 入 到 含10%DMSO 溶液的100 μL DMEM 培养基中（每个浓度设置3 组平行实验）。将上述用不同浓度GCTONOO 标记的PC12 细胞孵育24 h 后，在每孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，继续培育4 h，除去上清液，再加入150 μL DMSO 溶液，低速振荡10 min，用酶标仪测试各体系在490 nm 处的吸光度。根据GCT-ONOO 标记组和对照组的吸光度计算细胞存活率。

2 结果与讨论

2.1 探针GCT-ONOO 的水溶性

首先考察了GCT-ONOO 与ONOO-反应后的水溶性。图3 为不同浓度（0.25～25 μmol/L）GCTONOO 与300 μmol/L ONOO-反应后的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱。由图3 可知，体系最大吸收峰（385 nm）处的吸光度值与GCT-ONOO 浓度呈现出良好的正比例关系，相关系数R2=0.996；在GCT-ONOO 浓度达到25 μmol/L 时，最大吸光度仍在上升，说明GCT-ONOO 具有良好的水溶性。这为GCT-ONOO 用于水溶液检测和细胞成像奠定了基础。

图3 （a）不同浓度GCT-ONOO 与ONOO-反应后的UV-Vis 光谱；（b）体系385 nm 处吸光度与GCT-ONOO 浓度的关系曲线Fig.3 (a)UV-Vis absorption spectra of different concentrations of GCT-ONOO reacted with ONOO-;(b)the relationship between the absorbance at 385 nm of the system and the concentration of GCT-ONOO

2.2 探针GCT-ONOO 的双光子荧光活性截面

通过双光子诱导荧光法测定并计算GCTONOO（5 μmol/L）与ONOO-（80 μmol/L）反应前后的双光子荧光活性截面，结果如图4 所示。实验结果表明，在760～900 nm 范围内，GCT-ONOO与ONOO-反应前双光子荧光活性截面很小，而反应后在860 nm 处出现最大的双光子荧光活性截面（262 GM），表明该荧光染料具有良好的双光子性能，可应用于双光子共聚焦成像。

图4 GCT-ONOO 与ONOO-反应前后在不同激发波长下的双光子荧光活性截面Fig.4 Two-photon fluorescence active cross section of GCT-ONOO probe reacting with or without ONOOat different exciting wavelengths

2.3 探针GCT-ONOO 的光物理性质

进一步测试了GCT-ONOO（10 μmol/L）与ONOO-（80 μmol/L）反应前后的UV-Vis 光谱和荧光发射光谱。由图5(a)可以看出，GCT-ONOO 反应前的吸收峰强度可忽略不计，而与ONOO-反应后在385 nm 处荧光强度显著增强，出现强吸收峰。由图5(b)可以看出，反应前探针背景荧光强度很低，反应后在520 nm 处出现强吸收峰，Stokes 位移达到135 nm。

图5 GCT-ONOO 与ONOO-反应前后的UV-Vis 光谱(a)和荧光发射光谱(b)Fig.5 UV-Vis spectra (a)and fluorescence emission spectra (b)of probe GCT-ONOO reacting with or without ONOO-

2.4 探针GCT-ONOO 的荧光响应

探 究 了GCT-ONOO(10 μmol/L, pH 7.4,含10% DMSO)对不同浓度ONOO-(0～80 μmol/L)反应35 min 后的浓度依赖关系。如图6(a)所示，随着ONOO-浓度的不断增加，反应体系在520 nm 处的荧光强度不断增强，加入ONOO-(80 μmol/L)比未加ONOO-的反应体系荧光强度增加了34.6 倍。图6(b)为520 nm 处荧光强度与ONOO-浓度的关系曲线。图6(c)显示，在0.5～60 μmol/L 之间，GCTONOO 溶液的荧光强度与ONOO-浓度之间存在良好的线性关系，相关系数达0.996，由3σ/k（σ表示11组GCT-ONOO 溶液(10 μmol/L)在520 nm 处的荧光强度标准偏差，k表示GCT-ONOO 滴定光谱曲线在线性范围内的斜率）计算得到检出限LOD 为13.5 nmol/L，说明该探针的灵敏度高。图6(d)显示，探 针GCT-ONOO 与ONOO-（30、60 μmol/L）可在35 min 内反应完全，之后随着时间延长体系荧光强度基本保持不变，表明该探针对ONOO-的响应较快。对GCT-ONOO 与ONOO-（60 μmol/L）在不同pH 值的PBS 缓冲液中的荧光响应进行了考察。如图6(e)所示，pH 值对未加入ONOO-的GCT-ONOO 荧光强度几乎无影响，而对加入ONOO-（60 μmol/L）后的体系荧光强度影响较大；pH 5.0～5.8 范围内，GCT-ONOO 与ONOO-反应后荧光强度基本没有变化，而pH 5.8～8.4 范围内，体系的荧光强度随着pH 值的增加逐渐增强。这是因为在碱性条件下，GCT-ONOO 与ONOO-反应产物中的羟基变为氧负离子，给电子能力增强而发出更强的荧光。本文还探讨了GCT-ONOO(10 μmol/L)对13种不同干扰物的响应情况(1.0 mmol/L Hcy、GSH、Cys，100 μmol/L H2O2、O2•-、HClO、NO、NO2-、H2S 和20 μmol/L Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+)。如图6(f)所示，除ONOO-外，干扰物分子均未使探针GCT-ONOO 的荧光强度发生明显变化，显示该探针对ONOO-具有高度的选择性。

图6 (a）GCT-ONOO 与不同浓度ONOO-反应的荧光发射光谱；（b）荧光强度和ONOO-浓度的关系曲线;(c)GCT-ONOO荧光强度与ONOO-浓度的线性拟合曲线；（d）GCT-ONOO 与ONOO-反应不同时间的荧光强度；（e）pH 值对GCT-ONOO与ONOO-体系荧光强度的影响；（f）GCT-ONOO 对ONOO-的选择性Fig.6 (a)Fluorescence emission spectra of the reaction between GCT-ONOO and different concentrations of ONOO-;(b)the relationship curve between fluorescence intensity and ONOO- concentration;(c)the linear fitting curve of fluorescence intensity and ONOO- concentration;(d)the fluorescence intensity of GCT-ONOO and ONOO- at different time;(e)the effect of pH value on fluorescence intensity of GCT-ONOO and ONOO- systems;(f)selectivity of GCT-ONOO to ONOO-1～16 in（a）：ONOO- 0，0.5，2，4，6，8，10，12，15，20，30，40，50，60，70，80 μmol/L

2.5 探针GCT-ONOO 的细胞毒性

为了考察GCT-ONOO 能否用于细胞内ONOO-的检测，采用MTT（噻唑蓝）法评估GCTONOO 的细胞毒性。结果显示，PC12 细胞与不同浓度（0～30 μmol/L）的GCT-ONOO 共孵育24 h，细胞存活率仍达到93%以上，说明该探针细胞毒性低，可用于后续的细胞成像分析。

2.6 细胞外/内源性ONOO-的检测

先考察GCT-ONOO 对细胞外源性ONOO-的荧光成像。 在PC12 细胞中加入不同浓度的ONOO-释放剂SIN-1（0、5、10、30 μmol/L）孵育30 min 后，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）继续孵育20 min，然后进行细胞成像。从图7 结果可知，体系荧光强度随ONOO-浓度的增加而增强，表明该探针可实现对外源性ONOO-的检测。

图7 （a）GCT-ONOO 与不同浓度SIN-1（0, 5, 10, 30 μmol/L）在细胞中的双光子激光共聚焦成像；（b）（a）图中各组细胞的相对荧光强度Fig.7 (a)Two-photon laser confocal imaging of GCT-ONOO and different concentrations of SIN-1(0,5,10,30 μmol/L)in cells;(b)the relative fluorescence intensity of the corresponding cells in figure (a)λex=860 nm，λgreen=480-580 nm；the scale is 40 μm

SIN-1 之所以可释放ONOO-是因为它可同时释放NO 和O2•-，随即反应生成ONOO-[17]。因此，为了排除其他干扰物如活性氧及活性氮存在的潜在干扰，在体系中分别加入HClO 及ONOO-清除剂Minocycline（二甲胺四环素）、O2•-清除剂TEMPO（四甲基哌啶氮氧化物）和NO 合成酶抑制剂AG（氨基胍）3 种试剂，设置了6 组细胞实验：a 组将PC12细胞用GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min 建立Sham 组；b 组 中 加 入30 μmol/L HClO 孵 育30 min后，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min；c 组将PC12 细胞置于30 μmol/L SIN-1 孵育30 min后，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min 建立对照组；d～f 组在加入30 μmol/L SIN-1 孵育30 min 后，再分别加入5 μg/mL Minocycline、TEMPO和AG，然后加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min。如图8 所示，加入SIN-1 后体系荧光强度显著增加，而加入3种抑制剂及HClO 后，荧光强度相对于对照组几乎可忽略，进一步表明GCT-ONOO 在细胞中可灵敏且特异性地识别ONOO-。

图8 （a）各组细胞（a-f）的双光子激光共聚焦成像；（b）(a)图中各组细胞的相对荧光强度Fig.8 (a)Two-photon laser confocal imaging in each group of cells (a-f);(b)the relative fluorescence intensity of each group of cells in figure (a)λex=860 nm，λgreen=480-580 nm；the scale is 40 μm

进一步考察了GCT-ONOO 对细胞内源性ONOO-的荧光成像。设计了5 组实验：a 组为Sham组；b 组加入1 μg/mL 脂多糖（LPS）、100 ng/mLγ-干扰素（IFN-γ）和10 ng/mL 佛波酯（PMA）进行预处理以刺激细胞发生炎症并产生内源性ONOO-，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min 建立对照组；c～e 组在加入与b 组等量的LPS、IFN-γ和PMA 后，分别加入20 μg/mL Minocycline、TEMPO和AG 三种试剂孵育30 min，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）继续孵育20 min。如图9 所示，只加LPS、IFN-γ和PMA 三种刺激剂时，体系绿色荧光显著增强（b 组），而加入Minocycline、TEMPO 和AG 后（c-e 组），却只显示很微弱的荧光。结果表明，GCT-ONOO 可用于检测细胞内源性ONOO-。

图9 （a）GCT-ONOO 与细胞内源性ONOO-的双光子激光共聚焦成像；（b）（a）图中各细胞组的相对荧光强度Fig.9 (a)Two-photon laser confocal imaging of GCT-ONOO and cellular endogenous ONOO-;(b)the relative fluorescence intensity of the corresponding cells in figure (a)λex=860 nm，λgreen=480-580 nm；the scale is 40 μm

3 结 语

本文采用具有优异双光子荧光活性截面的GCTPOC 为双光子荧光团、以1-甲基吲哚啉-2,3-二酮为ONOO-的识别基团，设计并合成了一种ONOO-双光子荧光探针GCT-ONOO。该探针水溶性较好，荧光响应倍数较高（荧光强度增加34.6倍）、响应速度较快（35 min）、灵敏度好（检出限低至13.5 nmol/L）、Stokes 位移大（135 nm），选择性好，且可用于检测细胞外源性ONOO-，并成功应用于细胞炎症模型中ONOO-的荧光成像分析。