苏州地区非结核分枝杆菌病病原学流行特征分析

刘佳 肖玉梅 曾令武 张耀刚 包紫薇 吴妹英

江苏省苏州市第五人民医院，苏州大学附属传染病医院肺科，苏州 210000

由于艾滋病的流行、人口老龄化、环境问题和免疫抑制剂的使用等相关因素的影响， 近年来非结核分枝杆菌（NTM）致病率越来越高，在很多国家和地区已成为重要的公共卫生问题之一[1-3]。NTM 病诊断困难且耐药率高[2,4]，导致诊疗难度加大。目前常规运用分枝杆菌培养法检测NTM，虽然检测费用低，操作简便，但检测时间长，容易造成患者失访，导致治疗延误。 随着生物信息学的迅速发展，全基因测序可以快速检测和鉴定NTM[5]，已被越来越多地应用于临床， 成为鉴定NTM 的另一项 “金标准”[2,6-7]。 本研究利用第二代全基因测序法来分析苏州地区NTM 病的菌种分布及流行趋势，并通过基因进化树研究NTM 病是否存在人际间传染的可能， 为今后合理地诊疗NTM 病提供参考，现报告如下。

对象与方法

一、研究对象

收集 2014年 1月至 2019年 1月就诊于苏州市第五人民医院诊断为NTM 病患者信息， 包括性别、年龄、居住地、职业等，同时收集患者痰、肺泡灌洗液、脑脊液、尿沉渣、胸腹水等样本，所有样本均经分枝杆菌培养提示阳性，同一患者相同样本来源仅选取1 株。 另选取1例患者不同时期2 株菌株用于基因进化树中比对分析。 本研究通过苏州市第五人民医院医学伦理委员会批准 [伦理审批号：(2021)院伦理审字（012）号]。

二、研究方法

1.分枝杆菌培养

在样本瓶里加入等量的4%氢氧化钠（NaOH）处理液，混匀；取5 mL 处理后样本置入50 mL 已标记的离心管中，放入振荡器上强力涡旋振荡30 min，混匀；在离心管中加入pH 6.8 PBS 缓冲液至40 mL后离心15 min，相对离心力2 572×g；倒去上清液，加入 1~2 mL 的 PBS 缓冲液，中和 pH 至 6.8。 样本接种前， 在BBL MGIL 培养管中先加入营养添加剂(OADC)和杂菌抑制剂(PANTA)混合添加剂0.8 mL，抽取0.5 mL 已处理样本注入MGIT 培养管中，将接种好的MGIT 培养管放入BACTEC MGIT 960 Tb 全自动分枝杆菌快速培养鉴定药敏仪（美国BD 公司）中培养。

2. DNA 提取及测序

使用核酸提取试剂盒进行各类样本中DNA 的提取（美国BD 公司MGIT 960 型全自动分枝杆菌检测仪），并进行扩增（杭州博日科技有限公司PCR 扩增仪）。

将提取的DNA 外送行全基因测序 （杭州迪安检测公司）， 具体方法如下：（1） 将 DNA 打断成约400 bp 大小的片段， 在DNA 片段两段加上一定序列的接头，PCR 扩增进行文库的富集，Qubit 对纯化后的文库浓度进行检测， 用Agilent420 检测文库片段大小， 用 Q-PCR 检测文库的摩尔浓度；（2）用NaOH 进行 DNA 文库的变性， 产生 DNA 单链，用HT1 缓冲液将变性后的文库进行稀释至上机浓度；（3）IlluminaRNextseq 测序仪 （美国 Illumina 公司）进行测序。

3. 全基因组共线性分析

对2 组同源性100%的菌株进一步行全基因组共线分析。使用MUMmer 软件（Version 3.23）进行菌株比对，确定基因组间的大范围共线性关系，共线范围大，亲缘性更近。 使用 LASTZ（Version 1.03.54）对区域间进行比对，确认局部位置排列关系，并从中查找易位、倒置、易位+倒置的区域，菌株间发生更少的易位、倒置，进化关系尺度更小。

三、统计学方法

采用描述性流行病学方法进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用表示， 计数资料采用例数、株数和率表示。

结 果

一、流行特征

共收集到NTM 病患者67例，其中2014—2018年64例。2014—2018年不同年份NTM 病的分布情况详见表1，表中可见检出数逐年增多，总体上女性多于男性，农村多于城市，职员发病率较少，基础疾病以合并糖尿病较常见。

表1 苏州地区2014—2018年非结核分枝杆菌病患者分布情况（n=64）

二、不同检测方法结果对比

67 株NTM 菌株均采用全基因测序法检测、传统分枝杆菌培养结合PCR 芯片技术检测。全基因测序法检测结果有胞内分枝杆菌38 株（56.7%），堪萨斯分枝杆菌 13 株 （19.4%）， 脓肿分枝杆菌 10 株（14.9%），鸟分枝杆菌 5 株（7.5%），草分枝杆菌 1 株（1.5%）。 传统检测法显示有59 株菌种与全基因测序法一致，另有8 株结果不同，全基因测序法与传统检验法的诊断一致率达88.06%（59/67）。

三、基因进化树分析

68 株（含 1例患者不同时期 2 株菌株）NTM 菌株基因进化树分析见图1。 图1 显示有2 组菌株同源性均为100%，分别是SZWY1 和SZWY2（同一患者不同时期菌株）、SZWY5 和SZWY65（不同患者菌株）； 堪萨斯分枝杆菌菌株间的同源性高于胞内分枝杆菌菌株间、鸟分枝杆菌菌株间、脓肿分枝杆菌菌株间的同源性。

图1 68 株非结核分枝杆菌菌株基因进化树

对2 组同源性100%的菌株进行全基因组共线分析发现：SZWY1 和SZWY2 的共线性范围明显大于SZWY5 和SZWY65，且两组的变异均以易位基因为主。 同一患者的共线范围大于不同患者，亲缘性更近，菌株间发生更少的易位、倒置，进化关系尺度更小，保留更多的保守区域，同一患者体内不同时期的菌株，更支持内源性复燃。

讨 论

NTM 具有地域性分布特征，好发于我国南方沿海地区[8-9]，据报道我国华北、东北地区NTM 菌株以胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌为主[8]。 本研究统计共发现苏州地区有5 种NTM 菌种： 分别为胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌，以胞内分枝杆菌为主，与既往本地区研究结果一致[8]。

目前尚无研究支持NTM 人与人之间具有传染性。 本研究利用全基因测序结果，构建基因进化树发现，胞内分枝杆菌菌株间、鸟分枝杆菌菌株间、脓肿分枝杆菌菌株间同源性总体偏低，暂不支持人际传播，但本文发现堪萨斯分枝杆菌菌株之间同源性总体偏高， 不排除有传染性可能。 同一患者相隔2年提供的菌株分析显示，NTM 在人体内的变异较慢，考虑内源性复燃。 另外发现2 株菌株同源性为100%， 查阅2 株菌株来源患者的临床资料， 显示SZWY5 株来源患者为男性，60岁， 苏州园区人，无业，SZWY65 株来源患者为女性，74岁，苏州相城区人，农民，患者间无亲属关系，无明确接触史，有待搜集更多的临床资料做进一步验证。 本文共线性分析说明同一患者不同菌株和不同患者不同菌株同源性虽为100%，但共线性范围不同，同一患者比不同患者的亲缘性更近。

综上，随着近来对NTM 的重视，全基因测序法将会越来越多地用于NTM 的诊疗，NTM 患者的遗传学信息和基因变异信息也将趋于明朗[9]，以期为今后的临床诊疗及预后评价提供一定的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明刘佳、吴妹英：直接参与、文章撰写、工作支持；肖玉梅、曾令武：文章撰写、工作支持；张耀刚：直接参与；包紫薇：直接参与、工作支持