三维氮掺杂碳纳米球的制备及其电化学传感性能应用——推荐一个分析化学综合实验

闫晓义，马强，魏士刚，张志权，郭玉鹏

1吉林大学化学学院，长春 130012

2吉林大学国家级化学实验教学示范中心，长春 130012

随着激烈的人才竞争以及专业教育向素质教育的转变，逐步培养学生实验技能的全面性、科研思维的创新性以及综合实验的连续性成为化学实验教学的改革目标。因此，开展综合设计性实验项目的重要性不言而喻。大学综合化学实验一方面可以提升本科生对于实验内容综合性和技能全面性的掌握能力，另一方面更为重要是能够使本科生建立“合成-表征-应用”的科研思维模式，逐步培养对于实验思路的自主创新能力[1,2]。

1 本实验的教学背景和教育价值

本校化学学院本科生通过一、二年级学习化学基础理论课及实验课，掌握了无机、分析、有机及物理化学实验技能，已初步具备开展科学研究的能力。但由于各专业实验课程不同的考查重点及较弱的关联紧密性等特点，学生并不能全面认知自身实验技能的应用方向，因此学生对于整体科学研究设计思路及统筹安排尚不清晰。综合设计实验课程的目的在于融会贯通各专业理论知识及实验技能，在夯实基础的同时循序渐进地引导学生完成创新实验设计，使学生从整体上把握实验的设计思路及规划安排。随着实验的逐步深化，新的科研实验问题也需要及时调整原有的研究方法和实验手段，从而进一步激发学生的科学研究兴趣和主观能动性。基于以上考虑，综合实验课程面向三年级以上本科生，包括各专业拔尖及保研直博生，本文所讲实验即是其中之一。

碳材料具有导电性强、机械强度高、比表面积大、化学稳定性高、生物相容性良好等优点，但其化学惰性限制了其在高性能器件领域的应用。将杂原子引入碳材料能够优化调控整体结构电子分布、实现表面功能化，是提升碳材料电催化性能的有效手段[3]。通过选择和改变掺杂原子的种类和含量，可以有效地对碳材料进行改性[4,5]。不同杂原子掺杂及杂原子间的协同作用会对碳材料催化性能的提升产生不同影响。与碳原子相比，氮原子在具备相似原子半径的基础上多了一个核外电子。当氮原子掺杂到碳基材料时，随着邻近碳原子电荷密度的改变，碳基材料的亲水性、反应性以及导电性亦随之改变。在材料制备过程中，选择不同的合成手段、不同的含氮前驱体能够获得多种氮掺杂碳基材料。

碳纳米材料虽然一直活跃在科学研究领域，但本科生对其制备方法及应用领域等方面尚不明确，因此本实验设计合成了难度不是很高的氮掺杂碳纳米材料，并以合成材料为基础探讨其在电化学传感器领域的应用。此实验涉及材料合成、结构表征、应用分析等方面，将检索文献、实验操作、基础表征、条件优化及分析测试等科研环节纳入其中，充分体现了综合实验的教学价值。第一，本实验能够把理论课知识与实验相结合，考查学生对所学知识的实际应用能力，有效加深并归纳对所学知识的理解；第二，实验过程能够融合各学科实验操作技能，加强学生各学科实验技能的关联紧密性；第三，通过整体实验设计、统筹安排、结果分析及撰写报告等过程的锻炼，学生能够逐步建立完整的科学研究思维模式，充分发挥自身的自主创新意识和团队协作精神。

2 实验设计思路及组织安排

2.1 实验设计思路

本实验以检测生物小分子谷胱甘肽为目标导向，设计合成氮掺杂碳纳米材料为电极修饰材料，成功构筑电化学传感器实现谷胱甘肽的分析定量检测。为培养学生自主创新能力，现提供以下设计思路供学生自由探索：(1) 制备三维氮掺杂碳纳米球材料时炭黑与三聚氰胺的比例是否会对材料结构产生影响；(2) 在制备修饰电极过程中，滴涂量是否会影响电化学传感体系的性能；(3) 不同实验条件(pH、扫描速度、富集时间)是否会对分析检测产生影响；(4) 进行体系抗干扰测试时，不同学生可选择不同分子种类进行测试分析。在进行整个实验时按照“制备合成-结构表征-分析应用”的设计思路(如表1所示)，注重各学科实验技能综合运用，培养学生的实际应用能力和自主创新意识。

表1 实验设计环节与具体目标、能力训练之间的关系

2.2 实验组织安排

此次综合化学实验需要28学时完成，可以多人讨论、分组进行。详细安排如下：

(1) 1-8学时：实验前安全教育，讲述实验内容，将学生分组，3-5人/组；根据实验设计初步完成三维氮掺杂碳纳米球的合成。

(2) 9-14学时：理解常规表征方法的原理，对所制备材料进行形貌与结构表征。

(3) 15-18学时：了解化学修饰电极的制备方法，对电极进行预处理。

(4) 19-28学时：掌握多种电化学技术及数据分析方法，完成电化学传感器性能优化及应用测试，并撰写实验报告。

3 学生实验示例

3.1 实验目的

(1) 了解氮原子在碳骨架中的基本构型及氮掺杂碳基材料在电化学传感器中的应用；

(2) 掌握电化学分析的基本原理和电化学工作站的基本使用操作；

(3) 掌握扫描电子显微镜、电化学阻抗、X射线衍射等常规表征技术；

(4) 掌握一种快速、稳定且高效检测谷胱甘肽的分析方法；

(5) 熟悉使用Origin、Photoshop等数据处理、图像编辑软件。

3.2 实验原理

3.2.1 碳基材料中氮原子构型

在碳骨架中，氮原子基本以下列四种构型存在：吡咯氮(pyrrolic-N)、石墨氮(graphitic-N)、吡啶氮(pyridinic-N)和氧化吡啶氮(oxidied-N)[6](图1)。其中，石墨氮中氮原子为sp3杂化，其位置相当于取代了碳六元环中的一个碳原子；吡咯氮和吡啶氮的杂化类型均为sp2，分别位于五元环和六元环位[7]；氧化吡啶氮构型是氮原子与一个氧原子和两个碳原子相连。需要特别注意的是，在高温条件下，吡咯氮极易转变为石墨氮和吡啶氮。因此，氮原子构型的不同会对碳基材料的电子结构和电荷分布产生重要影响，其自身催化和导电能力也将随之改变。然而，目前科学家对于哪种构型的催化能力最强有着不同看法。其中，有些科研人员认为吡啶氮催化性能较高[8,9]，还有部分研究者认为石墨氮拥有较强的催化活性[10,11]，与此同时也有研究人员认为这两种氮构型的催化性能基本相同[12]。

图1 碳基材料中氮原子的四种基本构型

3.2.2 电化学传感器

利用电化学和分析化学的基本原理，电化学传感器是一种可以将分析物的化学或生物响应信号(如浓度、离子活度等)转变为可被测量的电信号(如电流、电位等)的检测装置[13]。依据输出信号的不同，电化学传感器可分为电阻型传感器、电流型传感器以及电位型传感器。电化学传感器可由用于识别待测物响应信号的信号接收器和将接收的检测信号转化为电学信号的转换器两部分构成，其示意图如图2所示。

图2 电化学传感器示意图

谷胱甘肽(GSH)是一种生物体内常见的小分子物质，具有抗氧化和解毒的关键作用。谷胱甘肽在人体内的含量变化通常与某些疾病相关，因此发展快速、高效且稳定的GSH分析检测方法具有重要意义[14]。目前有关GSH的检测方法包括电泳法、光谱法、色谱法以及电化学法。其中，电化学法由于其操作简便、响应迅速及稳定灵敏等特点受到了大量科研人员的广泛关注。然而，由于GSH较高的过电位而无法在普通电级上进行快速灵敏检测，因此需要研发合适的电极材料用以构筑电化学传感器。本实验合成的三维氮掺杂碳纳米球(3D-N-CB)材料作为一种电极修饰材料，其中掺杂的氮原子能够诱导产生电化学活性位点，改变碳骨架的电荷分布并且提升整体电子传输速率，有效降低GSH的过电位并提升电催化响应信号。

3.3 实验用品

试剂：三聚氰胺从光复试剂有限公司购买。炭黑，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，磷酸二氢钾(KH2PO4)，谷胱甘肽购于北京化工厂。本实验中用到的试剂和药品都是分析纯。合成及配制过程中用水均为超纯水。0.1 mol·L−1的磷酸缓冲溶液(PBS)由Na2HPO4和KH2PO4配制。

仪器：管式炉(KSGD-6.3-16C，上海意丰)，扫描电子显微镜(SEM，FEI Nova Nano，US)，X射线衍射(XRD，D/Max2550 VB，CuKα射线，JPN)，拉曼光谱(Renishaw inVia, UK)，电化学工作站(上海辰华，920C)。

3.4 实验步骤

3.4.1 3D-N-CB的制备

首先，将150 mg炭黑(CB)和3 g三聚氰胺分散在20 mL乙醇/水(1 : 1，V:V)中，搅拌1.5 h后超声处理20 min得到均匀分散液。然后，在60 °C下将上述分散液干燥可得固体粉末，充分研磨后置于管式炉中。在N2的氛围下升温至600 °C并保持2 h，随后继续升温至900 °C保持2 h，设定加热速率为3 °C·min−1。最后，将产物自然冷却至室温后，得到样品3D-N-CB。此外，我们在相同条件下直接热解炭黑得到对照样品并记为CB-900。

3.4.2 修饰电极的制备

首先，分别使用粒径大小为0.3和0.5 μm的Al2O3粉末对裸玻碳电极(GCE)进行抛光处理，接下来依次使用1 : 1硝酸/水、乙醇和水超声清洗GCE 1 min，用N2吹干待用。将样品3D-N-CB用超纯水配制成1 mg·mL−1的分散液，使用移液器取10 μL均匀滴涂在GCE表面，置于干燥器中得到3D-N-CB/GCE。作为对照试验，用同样方法制备1 mg·mL−1CB-900的分散液，取10 μL均匀滴涂在GCE得到CB-900/GCE。

3.5 结果与讨论

3.5.1 材料表征

运用扫描电子显微镜对制备样品3D-N-CB进行微观形貌表征。通过图3可以清晰地看出，3D-N-CB呈现三维多层球状结构，纳米球直径尺寸大约为80 nm。该三维球状结构能够提供更大的比表面积以及更多的化学活性位点，在碳基材料提升电子传输效率的基础上为接下来GSH在电极表面的催化氧化过程提供帮助。

图3 3D-N-CB的扫描电镜图

采用XRD和拉曼光谱对3D-N-CB和CB-900样品结构进行表征分析。如图4a所示，两种热解所得样品均在26°显现出无定形碳衍射峰[15]，43.5°的弱衍生峰对应于碳(101)晶面。与CB-900样品相比，3D-N-CB在26°处衍射峰的强度更大表明其具有较高的石墨化程度。此外，通过拉曼光谱图4b可以观察到，样品均表现出两个吸收峰，1350 cm−1处的D带以及1569 cm−1处的G带。D带和G带的强度比值(ID/IG)表征了材料的石墨化和缺陷程度[16]。与CB-900相比，3D-N-CB具有较高的ID/IG值，说明N原子掺杂能够诱导碳层产生更多的边缘和结构缺陷，与XRD检测结果一致。

图4 3D-N-CB和CB-900的XRD和拉曼表征图

3.5.2 GSH在修饰电极上的电化学行为

图5采用CV法探究了5 mmol·L−1GSH在GCE、CB-900/GCE以及3D-N-CB/GCE上的电化学行为。由图5可清楚地看出，GCE对于5 mmol·L−1GSH产生的催化电流极低。与之相比，CB/GCE对GSH有一定的催化效果，其氧化峰电流明显提高。值得注意的是，3D-N-CB/GCE能够催化GSH产生更为显著的氧化峰电流，其电流值约为CB-900/GCE的2倍，表明N掺杂到碳骨架中会显著提高样品对GSH的电催化活性。此外，我们可以注意到，CB-900/GCE和3D-N-CB/GCE所产生的背景电流很大，证实了碳材料能够有效地提升修饰电极的比表面积，从而增大与待测物接触面积和增多催化活性位点。

图5 5 mmol·L−1 GSH在不同修饰电极上电化学行为

3.5.3 pH和扫描速度的影响

我们首先利用CV法探究了底液pH对催化过程的影响。由图6a可知，随着pH从6增加到9，GSH氧化峰电流先增加后降低，在pH为7.4时获得最大的响应电流。图6b显示了峰电位与pH的线性关系，随着pH的增加峰电位(Epa)向负方向移动，表明该反应催化氧化过程中有质子参与[17]。其线性回归方程可表示为Epa= −0.04475 pH + 0.8778 (R2= 0.9957)。

此外，我们用CV法研究了扫描速度对GSH在3D-N-CB/GCE催化的影响，结果如图6c所示。随着扫描速度的增加，GSH氧化峰电流(Ipa)也不断增加，其线性回归方程可表示为Ipa= 0.7080v1/2+ 6.317(R2= 0.9907) (图6d)。Ipa与v1/2成正比，表明GSH在3D-N-CB/GCE上的催化反应是由扩散过程控制的[18]。

图6 pH和扫描速度对于GSH在3D-N-CB/GCE上催化过程的影响

3.5.4 3D-N-CB/GCE的传感性能

为获得最佳的测量电位，我们首先采用计时安培法研究了不同电压对GSH测定的影响。如图7所示，在完成GSH进样后，3D-N-CB/GCE能够快速产生电化学响应电流并在短时间内达到稳态。在0.55 V获得最大响应电流，因此确定0.55 V为最佳测量电位。

图7 计时安培法探究测定电压GSH催化电流的影响

在最优实验条件下，采用计时安培法探究3D-N-CB/GCE的电化学传感性能。由图8a可知，3D-N-CB/GCE对GSH的催化响应快速并在4 s内达到稳态，表明了3D-N-CB材料优异的电催化性能。由图8b可知，GSH浓度在0.04-470 μmol·L−1和470-13470 μmol·L−1范围内变化时，氧化电流响应呈线性变化，线性回归方程可分别表示为Ipa(μA) = 0.009950C(μmol·L−1) + 0.08016 (R2= 0.9947)和Ipa(μA) = 0.02060C(μmol·L−1) + 4.671 (R2= 0.9898)，检出限为9 nmol·L−1(S/N= 3)。

图8 (a) GSH在3D-N-CB/GCE上的计时安培曲线以及(b) 响应电流与GSH浓度关系曲线

3.5.5 3D-N-CB/GCE的重现性、稳定性和选择性

为考查3D-N-CB/GCE的重现性，我们用同一根修饰电极对GSH进行10次平行测定，其电流的相对标准偏差(RSD)是3.65%，表明3D-N-CB/GCE具有优异的重现性。此外，我们通过将修饰电极放置一周后测定电流值考查其稳定性，结果表明3D-N-CB/GCE的电流响应是其原始值的91%，说明3D-N-CB/GCE具有良好的稳定性。最后，采用计时安培法考查了干扰物对GSH测定的影响。结果表明，10倍的和H2PO4−以及2倍浓度的葡萄糖、果糖、蛋氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸和赖氨酸加入后，GSH的电流值基本保持不变，说明3D-N-CB/GCE具有令人满意的抗干扰能力。

4 实验难点及注意事项

通过本次综合设计实验，学生们能够逐步形成合成-表征-应用的科研逻辑思维模式，有效提升学生的基础实验操作技能及独立分析解决问题能力，从整体上把握实验的设计思路，现将该实验难点及注意事项分析如下：

(1) 理论方面：① 如何使学生准确理解电化学三电极体系的工作原理及各种分析测试方法；② 氮原子四种基本构型及其催化性能介绍。

(2) 实验操作方面：① 对于玻碳电极的抛光处理需要仔细教学，否则极易损坏电极；② 由于大型仪器设备的价值较高，其使用教学需由专业人员进行培训；③ 如何选择适合的底液缓冲溶液；④ 每次进行电化学检测前需要在底液中进行一定时间的富集。

(3) 数据处理方面：① 难点在于不同表征手段数据的有效分析(SEM、XRD、拉曼光谱)，查询对应的特征峰；② 电化学数据方面需要根据不同分析方法进行数据分析。

5 实际教学及效果分析

5.1 实际教学学时安排

实验实际教学学时安排与设计学时安排相比略有改动(共计28学时)。其中安全教育用时2学时；搜集阅读文献及初步设计合成三维氮掺杂碳纳米球用时8学时；运用大型仪器对制备材料进行表征4学时；构筑修饰电极1学时；多种电化学手段测试分析共用时8学时(CV比较1学时、条件优化2学时、线性分析3学时、其他测试2学时)；数据分析处理及实验报告撰写用时5学时。

5.2 分层教学方法

在实际教学中，指导教师可以对不同年级及不同基础层次的学生进行分组辅导、因材施教。例如，对于大三年级学生，指导教师可给出详细的实验方案，按步骤手把手教学，使学生在充分理解实验整体思路的基础上提高自身的实验技能；对于学科拔尖或者保研直博学生，指导教师可以在课题方向不变的基础上让学生自主设计更为细化的实验方案，从而使学生在保持各自优势的同时互相促进和提高，从各个方面提升学生的综合素质能力。

关注学生水平差异，对动手能力和创新思维差异大的学生，提供针对性分组辅导，运用分层教学因人而异，因材施教。对低年级学生手把手教学、中年级学生通过指导书和示教板自主实验、高年级学生自行设计实验项目的分层教学模式，使学生保持各自特长的同时又能相互促进和提高，使学生个性化技能在通识化教育中得到全面提升。同时通过开展大量综合性设计性实验来提高学生的综合素质能力，充分调动学生学习的主动性和勇于开拓的创新意识。

5.3 教学效果分析

本实验已经正式实施两年，学生反响非常好，其教学效果可总结为以下几个方面：

(1) 该实验涉及三维氮掺杂碳纳米球的制备、结构与形貌表征以及其在电化学传感器方向的应用，能够让本科生对科研工作有正确的认识，初步建立“制备合成-结构表征-分析应用”的科研逻辑思维模式。

(2) 通过本实验的训练，本科生的文献查阅及自主学习能力显著提高；此外，该实验从产物合成以及分析应用等实验步骤都能显著提升本科生的实验操作技能及分析解决实际问题的能力。

(3) 分组模式能够有效促进学生之间的团队协作能力，多人讨论的方式更能提升每个学生的实验参与度，博采众长、全面优化实验方案；分层教学的特点能让不同基础的学生适应实验强度，逐步培养自身的自主创新能力。

(4) 实验中涉及管式炉、扫描电子显微镜、X射线衍射仪及拉曼光谱仪等大型设备仪器，能够使学生产生浓厚学习兴趣的同时掌握多种大型仪器的使用，为以后毕业论文及科研工作打下良好的基础。

6 结语

本实验介绍了一种新型谷胱甘肽的电分析检测方法，实验内容涉及材料制备、结构表征以及测试分析，能够从实验设计、科研思维以及操作技能等方面激发学生的科研兴趣，充分调动学生的学习主动性和勇于开拓的创新意识，有利于培养化学及材料相关专业学生的综合应用能力。根据此综合设计实验取得的教学效果，我们正在遴选和凝练新的综合创新实验项目，进一步拓展学生的科研思路，提升学生的自主创新能力和解决实际问题能力。