超高效液相色谱-串联质谱法同时分析地下水中24种内分泌干扰物

邹小南，罗 丹，李贵洪，王娅南，彭 杰，王淑婷，郭 峰，战 楠，贾 静，朱 帅，赵 虎

1.贵州工程职业学院，贵州 铜仁 565200 2.国家地质实验测试中心，北京 100037 3.重庆资源与环境保护职业学院，重庆 402360

内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)是指外因性干扰生物体内分泌的化学物质，又称为环境激素[1]。该类化合物可对生物体的免疫系统、生殖系统及神经系统产生干扰，进而导致相关疾病的增发，在甲状腺疾病方面的影响尤为突出[2-5]。以双酚A(BPA)为例，其能导致人体内分泌失调，可能会威胁到胎儿和儿童的健康，因此，许多国家和地区已禁止生产含BPA的婴儿奶瓶。BPA、雌二醇(E2)、炔雌醇(EE2)、氢化可的松(CRL)在环境水体和土壤中的检出频率非常高，已造成一定程度的环境污染[6-10]。地下水是我国的主要饮用水源之一。天然和人工合成的内分泌干扰物在生产和使用过程中会通过淋滤作用进入地下水，从而对地下水质量构成潜在威胁。国家“十四五”规划和2035年远景目标纲要明确提出了“重视新污染物治理”的工作部署。内分泌干扰物是新污染物的典型代表，对其在地下水中的污染状况开展调查势在必行[11-16]。地下水中的内分泌干扰物具有浓度低和性质差异大的特点，因此，亟待建立可同时分析测定地下水中多类内分泌干扰物的高效分析方法，以满足调查监控的需求。

目前，国内外用于测定环境介质中内分泌干扰物的方法多为液相色谱-质谱联用[17-20]和气相色谱-质谱联用[21-23]两种技术。气相色谱-质谱联用技术耗费低、灵敏度高，但其前处理需要经历衍生化步骤，操作烦琐。液相色谱-质谱联用技术前处理相对简单，选择性好且无需衍生化,因此，目前多采用高效液相色谱-质谱法测定环境中的内分泌干扰物。国内有学者采用超高效液相色谱-质谱联用技术分析了污水中的雌激素水平，但所分析的物质种类相对单一[24-26]。不同种类的激素在质谱源中的电离模式不同，通常需分开测定，导致分析时间长，分析效率有待提高。在实际研究中，环境水体中往往多类内分泌干扰物共存，而可同时测定多类内分泌干扰物的高效分析方法则相对较少[27-32]。为更全面、快速地分析地下水中的痕量内分泌干扰物，亟待建立准确可靠、可实现不同类别内分泌干扰物同时分析的方法[33]，以满足地下水中痕量内分泌干扰物分析的需要。

本研究选择常见的9种雌激素、5种雄激素、3种肾上腺皮质激素、4种酚类化合物和3种人工合成的非甾类激素共24种典型内分泌干扰物为目标分析物，通过重点优化固相萃取时的pH、色谱条件及质谱参数，建立了基于超高效液相色谱-串联质谱法同时分析地下水中24种内分泌干扰物的方法，并将其应用于实际地下水样品分析，以期为地下水中多种内分泌干扰物的同时测定提供可靠的技术方法。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪(美国AB SCIEX，API4000)，固相萃取装置(美国Waters，wat200609)，氮吹仪(常州欧诺德，ODSL-12)，超纯水仪(美国Millipore，Milli-Q)，Oasis MCX固相萃取小柱(美国Waters，500 mg，6 mL)，Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱(美国Agilent，2.7 μm，100 mm×2.1 mm)，ACQUITY UPLC BEH色谱柱(美国Waters，1.7 μm，50 mm×2.1 mm)。实验过程所用试剂见表1。

表1 主要试剂Table 1 The main reagent

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备液的配制

准确称取固体标准品0.005 0 g，用甲醇溶解后定容于5 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，密封并置于温度为4 ℃的冰箱中保存备用。

分别移取100 μL目标物标准储备液，放入10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成浓度为10 μg/mL的混合储备液。

1.2.2 标准工作液的配制

移取不同体积的混合储备液于10 mL棕色容量瓶中，加入100 ng内标物质标准溶液，用甲醇定容，配制成浓度梯度为1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 ng/mL的标准工作液。

1.3 样品的采集及前处理

本研究参考《地下水环境监测技术规范》(HJ 164—2020)，在河北省8个地级市采集了48个地下水样品。在每个采样点，用待采水样冲洗硬质玻璃瓶3次后，采集监测水井中水面下10～30 cm处的潜水(浅层地下水)，并用浓硫酸调节水样pH至3及以下。将样品运送至实验室后，1～5 ℃避光冷藏。所有样品于48 h内完成处理并测定。

取上清液，经0.45 μm玻璃纤维膜过滤后，量取1 L水样，加入10 ng内标物质。依次用6 mL甲醇、6 mL pH=5的超纯水充分活化Oasis MCX固相萃取小柱，然后将上述1 L已准备好的水样过柱(流速控制在5～10 mL/min)。上样完成后，用6 mL pH=5的水进行清洗，使固相萃取柱上富集的水溶性离子化合物脱离，随后真空抽取10 min以去除水分。最后，用9 mL碱化乙腈(4.5%，体积分数)洗脱，氮气吹干，并用甲醇定容至1.0 mL待上机分析。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱分析条件

采用Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱对目标化合物进行分离。柱温30 ℃，进样量10 μL，流速始终为0.3 mL/min。流动相D为0.1%氨水溶液，流动相B为乙腈。

梯度洗脱条件：0.0 min，35% B；0.0～5.0 min，35%～95% B；5.0～10.0 min，95% B；10.0～10.5 min，95%～35% B；10.5～14.0 min，35% B。

1.4.2 质谱分析条件

采用MRM模式划分时间窗口采集正、负离子。离子源：电喷雾(ESI)；电离模式：正负离子分段采集；气帘气(CUR)压力：20 kPa；碰撞气(CAD)压力：20 kPa；电喷雾电压：5 000 V；辅助气1(GS1)压力：40 kPa；辅助气2(GS2)压力：0 kPa；接口加热器(Ihe)：开；入口电压(EP)：10 V；离子源温度(TEM)：500 ℃。在负离子模式下分析酚类化合物、非甾类激素及部分雌激素，在正离子模式下分析雄激素、肾上腺皮质激素及部分雌激素(表2)。

表2 地下水中24种内分泌干扰物的质谱参数和保留时间Table 2 MS parameters and retention time of the 24 endocrine disrupting chemicals in the groundwater

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

对比了ACQUITY UPLC BEH与Poroshell 120 Bonus-RP两种色谱柱的分离效果，发现后者对目标物的分离度更高，可使雄激素和孕激素等实现较好的分离。为获得最佳分离度和分析灵敏度，对比了分别以甲醇和乙腈为流动相时的分离情况。结果表明，以甲醇和乙腈为流动相时，大多数物质均可获得较好的分离度和峰形，但以乙腈为流动相时，E1和Dieno、ME-Prednl和NDL等出峰时间相近的物质的分离度更好，故有机相选用乙腈。当流动相选用超纯水时，雌激素的响应不高。在水相中加入0.1%的氨水后，负离子采集模式下的雌激素的响应值提高了2～3倍，同时保证了对孕激素和雄激素等目标物的测定。因此，最终选择0.1%氨水溶液-乙腈作为流动相。在此条件下，24种内分泌干扰物的峰形好、信号强、分离效果佳(图1)。

图1 24种内分泌干扰物的提取离子色谱图Fig.1 Extraction ion chromatograms of 24 endocrine disruptors chemicals

2.2 前处理条件的优化

本文根据目标化合物结构中含有羟基和苯环的特点，采用了MCX混合型弱阳离子交换柱。这类经羧基修饰的混合型弱阳离子吸附剂的苯环具有较强的疏水作用，羧基则提供了弱阳离子交换能力。对比pH=3和pH=5的水溶液的富集回收效果，结果(图2)表明：用pH=5的水溶液进行富集时，大多数目标化合物的富集回收率在50%～90%之间；用pH=3的水溶液进行富集时，富集回收率大多在10%～80%之间。

图2 不同pH洗脱液的各物质回收率Fig.2 The recoveries of eluentswith different pH values

2.3 线性范围、检出限及定量限

将质量浓度不同的混合标准工作溶液按优化后的质谱参数和色谱条件进行测定。以类固醇激素定量离子质谱峰的面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，作标准曲线及回归方程。依据《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)开展方法检出限验证。线性方程、决定系数、方法检出限和线性范围见表3。从表3可见，在对应的浓度范围内，24种物质呈现良好的线性关系，决定系数R2均高于0.995，检出限在0.05～2.00 ng/L之间。在现有文献报道中，罗洲飞等[24]建立了利用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定环境水样中20种环境内分泌干扰物的方法，其方法检出限为0.04～0.51 ng/L；王晓燕等[17]采用分散液液微萃取-衍生化高效液相色谱-荧光检测法测定了环境水样中的4种酚类内分泌干扰物，其方法的检出限为0.9～1.6 ng/L。本研究所建方法对各内分泌干扰物的检出限与现有文献报道中的检出限处于同一量级或优于现有水平，且线性范围宽，检出物质类别较多，定量准确度高，并通过正负离子切换扫描实现了对不同性质环境激素的同时测定，能更好地满足地下水中多类内分泌干扰物痕量分析的需要，具有较强的实用价值。

表3 24种类固醇激素的线性范围、线性方程、决定系数、检出限Table 3 Linear range,linear equation,determination coefficient and limits of detection of 24 steroid hormones

2.4 方法准确性

向1.0 L超纯水中准确加入24种目标物标准混合溶液，最终的浓度水平分别为2、5、50、100、500 ng/L，各平行制备3份，做加标回收试验，考察本文所述方法的精密度和回收率。试验数据(表4)显示，24种目标物的平均回收率为68.8%～108%，相对标准偏差(RSD)在0.99%～9.80%之间，表明该方法的准确度高，能较好地满足地下水中痕量类固醇雌激素和雄激素同时分析测定的需要。

表4 加标地下水样中目标物的回收率、精密度Table 4 Recovery and precision of the target hormones in spiked water samples %

2.5 实际样品分析

将本文建立的测定方法运用于河北省8个地级市48个地下水样品的内分泌干扰物分析，结果显示，48个样品均有不同程度的内分泌干扰物检出。其中，E3、EE2、Pro、ADD、NDL在所有样品中均未检出，雌激素的检出浓度在未检出～17.19 ng/L之间，雄激素的检出浓度在未检出～40.42 ng/L之间。目标激素中，E2和T的检出率最高，两者的检出率、最大浓度分别为11.43%、17.19 ng/L和14.29%、3.03 ng/L。测定结果表明，该分析方法在实际地下水样品的内分泌干扰物测定方面具有较强的实用价值。

3 结论

本研究建立了一种可同时分析地下水中24种内分泌干扰物含量的液相色谱-串联质谱分析方法。研究结果显示,采用100 mm色谱柱进行分离时的效果较好,使用pH=5的水溶液进行富集回收时的效果更好。经验证，本研究所建方法对24种物质的平均回收率为68.8%～108%，RSD为0.99%～9.80%，线性相关系数均高于0.995，检出限为0.05～2.00 ng/L。将本文建立的测定方法运用于河北省8个地级市48个地下水样品的内分泌干扰物分析，结果显示：在检出的目标物中，E2和T的检出率最高，两者的检出率、最大浓度分别为11.43%、17.19 ng/L和14.29%、3.03 ng/L；E3、EE2、Pro、ADD、NDL在所有样品中均未检出。该方法灵敏度高、准确度好，可为地下水中痕量内分泌干扰物的测定提供一种快速、准确、可靠的技术方法，具有较强的实用价值。