盐酸右美托咪定对脓毒症小鼠谵妄的防治作用

王舜 倪燕华 万海方

脓毒症是机体受到严重感染时，多种炎症介质释放的全身炎性反应综合征，内环境平衡破坏，器官功能损伤。脓毒症诱发的脑损伤可致注意力下降，记忆减退，谵妄甚至昏迷等精神障碍［1］亦是引起住院病人死亡的重要因素［2］。脓毒症患者即使侥幸存活，亦可出现长期的诸如记忆减退，谵妄等认知功能障碍，造成患者较大的痛苦［1］。盐酸右美托咪定主要特点无呼吸抑制副作用，镇静、镇痛、抗焦虑作用显著，起效快，半衰期短，对神经、心血管、泌尿系统各脏器可能具有一定的保护作用［3］。研究显示，盐酸右美托咪定对脓毒症机体神经及脑保护有重要作用，可以减轻脓毒症诱发的脑损伤［4］。本文探讨盐酸右美托咪定防治脓毒症小鼠谵妄发生的作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 8~12周龄SPF级 C57BL/6N健康雄性小鼠64只购于常州文卡斯实验动物有限公司，体重（25±1.5）g，动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010。动物使用许可证号：SYXK（浙）2020-0005。置于温度（22±1）℃，湿度（60%±10%），光照（明，暗交替各12 h）环境下，自由饮水、普通颗粒饲料饲养1周。实验过程中对动物的处置符合相关动物伦理学标准。

1.2 试剂和仪器 盐酸右美托咪定注射液（江苏扬子江药业有限公司，批号：20061231）。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（武汉赛培生物批号：SP13726）、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒（武汉赛培生物批号：SP13701）；脂多糖［055：B5爱必信（上海）生物科技有限公司］；行为学仪器（上海欣软信息科技有限公司）；正置光学显微镜（日本奥林巴斯 OLYMPUS CK31）；酶标仪（美国Bio-rad公司）；旷场箱与新物体识别箱购自上海软隆。

1.3 方法 （1）分组：随机数字表法将小鼠分为4组，空白对照组、药物对照组、脓毒症模型组、药物保护组，每组各16只。每组再分为两个亚组（各8只），进行旷场实验与新物体识别实验。（2）动物模型建立：参照文献［5］脓毒症模型组腹腔注射脂多糖（LPS）20 mg/kg建模；药物保护组建模前15 min，腹腔注射40μg/kg盐酸右美托咪定；空白对照组在相同时间腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，而药物对照组相同时间腹腔注射等量盐酸右美托咪定，给药体积为50 mL/kg。（3）旷场实验［6］：评估进入新环境后小鼠的紧张程度及探索新环境的自主行为。能够比较客观反应实验动物进入陌生环境后的好奇度、行为习惯以及情绪变化。将实验小鼠置于长40 cm，宽40 cm，高40 cm旷场内记录小鼠运动总距离、进入中央格的次数、中央格停留时间、垂直运动数、探索次数、粪便粒数，共5 min。下午1∶30~3∶30在安静房间内进行。（4）新物体识别实验［7］：主要研究啮齿动物对新物体的偏好，记忆力，注意力和焦虑程度。将小鼠放入测试实验箱内，并将该箱放置于避光、隔音场所。实验过程进行3 d，分为适应期、熟悉期及测试期。适应期将实验小鼠在空箱内活动20 min。熟悉期将实验小鼠放入有2个大小、外观与材质相同的实验箱中活动。测试期替换熟悉期中的1个物体（大小、外观与用材完全不同）位置不变，脓毒症模型小鼠制成后，在3 h与24 h将小鼠放入箱内同一位置，并记录小鼠5 min内探究新物的时间Tn与探究旧物的时间Tf。小鼠识别新旧物体的能力由偏好指数Tn/（Tn+Tf）表示［7］。每只小鼠实验结束后，乙醇清理测试箱及物体清除异味避免干扰。（5）ELISA测定小鼠血清和海马中炎症因子TNF-α和IL-1β的水平：戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉每组小鼠，从眼球取血，用TNF-α和IL-1β试剂盒按操作流程测定血清TNF-α和IL-1β水平。（5）病理检测方法：建模24 h后，将处死的小鼠穿刺左心室0.9%氯化钠溶液冲洗至液体澄清后甲醛灌注，解剖出小鼠海马组织，新鲜组织固定于4%多聚甲醛＞24 h，将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织依次梯度酒精脱水、蜡块包埋，将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出。依次将切片放入二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min，无水乙醇Ⅰ10 min，无水乙醇Ⅱ10 min，95%酒精5 min，90%酒精5 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸馏水洗。切片入Harris苏木素染5~10 min，流水冲洗，1%盐酸酒精分化5 s，流水冲洗5 min，氨水返蓝3 min，流水冲洗。切片入伊红染液中染色3 min后将切片放入酒精脱水透明、晾干，中性树胶封片。正置光学显微镜观察海马组织结构。

1.4 观察指标 （1）旷场实验：比较四组小鼠运动总距离、进入中央格的次数、中央格停留时间、垂直运动数、探索次数、粪便粒数。（2）新物体识别实验：比较四组小鼠识别新旧物体的能力。（3）比较四组小鼠造模24 h后血清及海马组织TNF-α、IL-1β水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐时两两比较用SNK-q检验，方差不齐时用Tamhane T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠旷场实验 建模前各组小鼠指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。建模24 h后旷场实验结果：与空白对照组比较，药物对照组各项观察指标差异无统计学意义（P＞0.05）；脓毒症模型组进入中央格的次数，停留时间，垂直运动和粪便数量增加（P＜0.05），而运动总距离和探索次数减少（P＜0.05）；与药物对照组比较，脓毒症模型组进入中央格的次数，停留时间，垂直运动和粪便数量增加（P＜0.05），而运动总距离和探索次数减少（P＜0.05）；药物保护组比脓毒症模型组运动进入中央格的次数，停留时间，垂直运动和粪便均减少（P＜0.05），而运动总距离和探索次数增加（P＜0.05），差异无统计学意义，见表2。

表1 各组小鼠建模前旷场实验结果比较（±s）

表1 各组小鼠建模前旷场实验结果比较（±s）

组别 运动总距离（mm） 进入中央格次数（次） 中央格停留时间（s） 垂直运动数（次） 探索次数（次） 粪便粒数（粒）空白对照组（n=8） 16,120.50±1,876.74 23.88±2.03 23.00±1.31 23.75±2.49 6.00±1.31 3.75±1.03药物对照组（n=8） 15,977.63±2,303.24 23.38±2.39 22.88±3.72 25.50±2.45 5.63±1.69 3.38±0.92脓毒症模型组（n=8） 16,183.88±2,280.91 21.50±1.93 22.75±3.11 24.00±3.07 7.00±1.31 3.50±0.92药物保护组（n=8） 17,081.38±2,298.78 22.63±2.67 23.13±2.90 24.50±2.45 6.38±1.69 4.13±0.84 F值 0.426 1.652 0.025 0.693 1.208 1.010 P值 0.736 0.200 0.995 0.564 0.325 0.403

表2 各组小鼠建造模24 h后旷场实验结果比较（±s）

表2 各组小鼠建造模24 h后旷场实验结果比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与药物对照组比较，#P＜0.05；与脓毒症模型组比较，△P＜0.05

组别 运动总距离（mm） 进入中央格次数（次） 中央格停留时间（s） 垂直运动数（次） 探索次数（次） 粪便粒数（粒）空白对照组（n=8） 10,280.88±819.60 11.63±2.67 13.13±2.90 18.25±3.46 7.50±1.19 2.63±0.52药物对照组（n=8） 10,088.63±479.07 15.88±2.03 15.63±1.69 20.50±2.88 6.50±1.19 2.50±0.75脓毒症模型组（n=8） 6,909.50±2,464.74*# 21.75±2.82*# 20.88±2.64*# 28.63±2.67*# 3.75±1.28*# 3.75±0.71*#药物保护组（n=8） 10,042.50±885.75△ 12.50±2.45△ 12.63±1.68△ 22.06±5.17△ 6.00±1.31△ 2.75±0.46△F值 10.784 26.78 21.66 13.65 12.95 6.732 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.001

2.2 各组小鼠新物体识别实验结果比较 与空白对照组比较，各组训练阶段总探索时间差异无统计学意义；3 h时与空白对照组比较，脓毒症模型组偏好指数降低（P＜0.05），而药物保护组小鼠较脓毒症模型组小鼠明显升高（P＜0.05），24 h时脓毒症模型组小鼠及药物保护组小鼠偏好指数较3 h时降低，与空白对照组比较，脓毒症模型组偏好指数降低（P＜0.05），而药物保护组小鼠较脓毒症模型组小鼠明显升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠新物体辨别实验结果比较（±s）

表3 各组小鼠新物体辨别实验结果比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与3 h比较，#P＜0.05；与脓毒症模型组比较，△P＜0.05

组别 训练阶段总探索时间（S） 偏好指数3 h 24 h空白对照组（n=8） 170.13±5.44 64.88±2.29 59.88±1.25药物对照组（n=8） 169.88±4.52 66.75±2.12 61.25±3.28脓毒症模型组（n=8） 166.13±4.39 57.38±2.67* 49.13±2.03*#药物保护组（n=8） 170.63±4.57 61.88±2.23△ 54.00±1.31#△F值 1.515 24.463 55.06 P值 0.232 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各组小鼠海马组织结构观察 空白对照组小鼠海马组织神经细胞排列紧密整齐，细胞结构完整，细胞核清晰可见。药物对照组小鼠海马组织基本正常。脓毒症模型组小鼠海马组织神经细胞排列紊乱，细胞间隙增大，细胞结构不清晰，细胞核固缩深染，神经细胞变性，并伴有胶质细胞浸润。药物保护组小鼠海马组织神经元排列相对规律整齐，细胞形态较正常，细胞间隙稍微增大，变性细胞较少。见图1。

图1 各组小鼠海马组织切片（Harris苏木素染色 ×400）

2.4 各组小鼠血清及海马组织中TNF-α和IL-1β水平 药物对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；脓毒症模型组和药物保护组血清和海马组织中的TNF-α和IL-1β高于对照组（P＜0.05）；药物保护组低于脓毒症模型组（P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠造模24 h后血清及海马组织TNF-α、IL-1β水平比较（±s）

表4 各组小鼠造模24 h后血清及海马组织TNF-α、IL-1β水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与脓毒症模型组比较，#P＜0.05

组别 血清（ng/L） 海马组织（pg/mg·prot）TNF-α IL-1β TNF-α IL-1β空白对照组（n=8） 23.73±2.31 64.71±3.66 6.60±0.51 16.11±0.88药物对照组（n=8） 36.46±11.5 70.40±5.33 6.92±0.64 15.53±0.92脓毒症模型组（n=8）782.92±64.17* 151.08±16.18* 176.21±7.67* 52.13±3.72*药物保护组（n=8） 181.81±18.48*# 77.95±7.75*# 66.53±8.73*# 18.16±1.67*#F值 893.87 143.58 1504.90 555.87 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

脓毒症发病过程中，微血管屏障破坏、细胞缺氧、炎性体异常活化，炎症因子TNF-α和IL-1β异常增加［8］，释放出的炎症因子导致中枢神经系统剧烈炎性反应，神经元损伤、退行性改变甚至凋亡，最终导致人类及动物的学习和记忆能力减退、认知功能障碍［9］。本研究内毒素腹腔注射制备脓毒症模型，可较高程度模拟人体脓毒症发病过程中代谢变化、细胞凋亡及重要脏器损伤。通过观察脓毒症模型小鼠认知功能、学习能力，记忆力和情绪变化与旷场实验和新物体识别实验变化，以评估实验小鼠谵妄的发生率和严重程度。

盐酸右美托咪定通过激动突触前膜α2受体发挥镇痛、镇静以及交感抑制等重要作用［10］。近年来研究表明，右美托咪定可通过降低TNF-α、IL-2、IL-6和IL-1β等炎症因子水平抑制围术期炎性反应，可能与其交感抑制，减少炎症因子释放，提高血管反应等器官保护作用相关［11］。盐酸右美托咪定包含能与苯二氮类受体结合的咪达唑仑环结构［12］，研究表明单一应用苯二氮 类药物对脓毒症患者镇静，未发现与右美托咪定对脓毒症患者镇静相关的抗炎及神经保护作用，推测相关保护作用与α2肾上腺素能受体激动密切联系而与镇静作用无关［13］。

本研究结果显示，脓毒症小鼠血清炎症因子与海马组织内炎症因子均明显升高，而药物保护组血清及海马组织炎症因子水平则降低。新物体识别与旷场实验表明脓毒症引起小鼠严重的焦虑、认知功能下降，记忆力减退，对周围环境不适应，谵妄明显。盐酸右美托咪定不影响小鼠的自主活动及探索行为，不会使小鼠焦虑，认知能力和记忆力发生改变。药物保护组实验小鼠的谵妄程度远低于脓毒症模型组，证明盐酸右美托咪定可改善脓毒症小鼠谵妄状态，对于脓毒症所致谵妄具有一定的防治作用。从高倍显微镜病理观察可以得知脓毒症引起小鼠中枢神经系统严重损伤。应用盐酸右美托咪定保护可明显减轻脓毒症小鼠海马组织的损伤，具有脑保护作用。

综上所述，脓毒症小鼠脑内炎症因子与谵妄有显著相关性，而盐酸右美托咪定降低脑内炎症因子则是防治脓毒症相关谵妄发生的主要作用机制。本研究也有一定的不足之处，只进行了40μg/kg盐酸右美托咪定的药物保护，对盐酸右美托咪定对脓毒症相关谵妄的防治效果评价相对片面。在今后的研究中可以选用不同剂量盐酸右美托咪定药物保护，以期脓毒症相关谵妄防治最佳剂量。