miR⁃194⁃5p与分化型甲状腺癌术后转移相关性的探讨

黄月 付青 张茜 许海洋

甲状腺癌根据组织分化可分为分化型与未分化型两种，其中分化型甲状腺癌占全部甲状腺癌的75%，而分化型又包括乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌两种［1］。乳头状甲状腺癌生长缓慢，恶性度亦较低，早期可伴有颈部淋巴结转移，多数患者能获得良好预后；而滤泡状甲状腺癌恶性度高于乳头状甲状腺癌，肿块生长快［2］。Zhao 等［3］结果表明：甲状腺癌好发于儿童及中老年人群中，且女性发病率略高于男性，临床多表现为单一甲状腺结节、质地坚硬，超声下可见结节直径>1 cm、实体性，能与外周组织区分。手术治疗是分化型甲状腺癌常用的干预方法，借助手术能切除病灶组织，且多数患者可从中获益［4］。但是，仍有1.2%～4.2%患者进展为远处转移，5年生存率仅为36%［5］。外周血循环miRNAs 具有稳定性好、取材方便、检测成本低等优势，在检验医学中具有巨大的潜力［6］。王芳等［7］研究报道：miR⁃194⁃5p 在甲状腺癌组织中呈高表达，可通过调节肿瘤细胞促凋亡基因或凋亡抑制基因活性，参与肿瘤细胞的生物学过程。因此，本研究以北京天坛医院收治分化型甲状腺癌患者为对象，探讨miR⁃194⁃5p 与分化型甲状腺癌术后转移相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2020年12月至2021年12月首都医科大学附属北京天坛医院收治的分化型甲状腺癌患者198 例为对象，根据术后是否发生转移分为转移组与非转移组。转移组46 例，男15 例，女31 例，平均年龄（58.91±6.36）岁；平均体重指数（Body mass index，BMI）（23.14±3.49）kg/m2；甲状腺乳头状癌35 例，甲状腺滤泡状癌11 例。非转移组152 例，男43 例，女109 例，平均年龄（58.99±6.42）岁；平均BMI（23.43±3.52）kg/m2；甲状腺乳头状癌114 例，甲状腺滤泡状癌38 例。本研究获得伦理委员会批准，患者或家属签署同意书，两组临床资料比较差异无统计意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 纳入、排除标准

纳入标准：①符合分化型甲状腺癌诊断标准［8］，均经病理检查确诊；②均采用双侧甲状腺全切术治疗，且患者均可耐受；③术后拟行131I 治疗，且均未接受放化疗、生物免疫治疗与内分泌治疗。排除标准：①精神异常、严重肝肾功能不全或急慢性感染者；②内分泌系统与血液系统相关疾病、认知功能异常者；③既往合并其他恶性肿瘤史者或冠心病、心衰史者。

1.3 方法

1.3.1 术后转移判断

131I 治疗6 个月后对患者常规行131I 全身显像检查，检查仪器为SPECT/CT Discovery 670，购自于GE 公司。根据患者情况设定测定参数：步径速度9.2～10 cm/min，矩阵为256×1024，常规完成颈、胸部断层显像，6°/帧，合计采集60 帧，矩阵为64×64［9］。

1.3.2 标本采集

术前采集空腹外周肘静脉血5 mL，置于肝素钠抗凝管中，10 min 离心，速度8 000 rpm，离心半径8 cm。待上述操作完毕后，将标本转移到RNase⁃free 离心管中，10 min 离心，速度8 000 rpm，离心半径8 cm，去除细胞碎片与杂志，备用。

1.3.3 miR⁃194⁃5p 测定

采用实时荧光PCR 法测定各组miR⁃194⁃5p mRNA 水平，取上述分离的血清标本，采用Trizol法常规处理血液标本，完成总RNA 提取，采用紫外分光光度仪测定所提取的RNA 纯度，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定总RNA 纯度。采用PCR 试剂盒完成cRNA。待上述操作完毕后，完成逆转录：RNA 模板14 μL、2 μL Enzymemix，4 μL×RT缓冲液补充到20 μL，在PCR 检测仪上42℃1 h、95℃5 min，将合成的cDNA 放置在-20℃冰箱中，保存。设定反应体系：cDNA 模板8 μL、SYBRP Green mix 10 μL、PCR Primer mix 2 μL。引物设计如下：上游引物序列：5′⁃AGUGAAUUCUAC⁃CAGUGCCAUA⁃3′；下游引物序列：5′⁃CAGUA⁃CUUUUGUGUAGUACAA⁃3′；设定反应条件：95℃下预变性10 min、95℃变性15 s、60℃退火30 s、72℃下延伸30 s，上述操作均连续完成45 个循环，每个血液标本重复3 次，取CT 值。以β⁃actin作为内参，采用2⁃ΔΔCt完成不同血液标本中miR⁃194⁃5p mRNA 表达量［10］。

1.3.4 甲状腺水平测定及相关性分析

取上述分离的血清标本，采用电化学发光法测定患者促甲状腺激素（Thyroid stimulating hor⁃mone，TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（Free triiodo⁃thyronine，FT3）、游离甲状腺素（Serum free thyrox⁃ine，FT4）、甲状腺球蛋白（Thyroglobulin，Tg）及甲状腺球蛋白抗体（Thyroglobulin antibody，TgAb）水平，仪器为Roche cobas6000 电化学发光仪，购自于Roche 公司，所有操作严格遵循仪器与试剂盒说明书完成［11］。采用Pearson 相关性分析软件对分化型甲状腺癌患者miR⁃194⁃5p 与甲状腺相关激素完成相关性分析。

1.4 统计分析

采用SPSS 24.0 统计软件进行统计处理，计量资料采用（）表示，行t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miR⁃194⁃5p 及甲状腺功能比较

转移组与非转移组TSH、FT3、FT4 水平比较差异无统计意义（P>0.05）；转移组miR⁃194⁃5p、Tg及TgAb 水平高于非转移组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组miR⁃194⁃5p 及甲状腺功能比较（±s）Table 1 Comparison of miR⁃194⁃5p and thyroid function between the 2 groups（±s）

表1 两组miR⁃194⁃5p 及甲状腺功能比较（±s）Table 1 Comparison of miR⁃194⁃5p and thyroid function between the 2 groups（±s）

组别转移组非转移组t 值P 值n 46 152 miR⁃194⁃5p 2.41±0.38 1.02±0.24 6.015 0.000 TSH（mIU/L）79.78±6.35 80.11±6.36 0.191 0.846 FT3（pg/mL）3.20±0.63 3.18±0.61 1.217 0.539 FT4（pg/mL）10.32±0.79 10.34±0.83 0.996 0.693 Tg（ng/mL）48.69±5.29 5.72±0.67 74.395 0.000 TgAb（IU/mL）17.68±2.14 14.35±1.95 7.302 0.000

2.2 miR⁃194⁃5p、Tg 联合TgAb 在分化型甲状腺癌术后转移诊断效能

ROC 曲线结果表明：miR⁃194⁃5p、Tg 联合TgAb 在分化型甲状腺癌术后转移中诊断灵敏度与特异度高于单一检测（P<0.05）。见表2、图1。

表2 miR⁃194⁃5p、Tg 联合TgAb 在分化型甲状腺癌术后转移诊断效能Table 2 The diagnostic efficacy of miR⁃194⁃5p，Tg combined with TgAb in differentiated thyroid cancer postoperative metastasis

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

2.3 分化型甲状腺癌术后转移miR⁃194⁃5p 与甲状腺指标相关性

Pearson 相关性分析结果表明：分化型甲状腺癌术后转移miR⁃194⁃5p 与TSH、FT3、FT4 水平无相关性（P>0.05）；与Tg 及TgAb 水平呈正相关性（P<0.05）。见表3。

表3 分化型甲状腺癌术后转移miR⁃194⁃5p 与甲状腺指标相关性Table 3 The correlation between miR⁃194⁃5p and thyroid indexes after the operation of differentiated thyroid cancer

3 讨论

分化型甲状腺癌恶性程度相对较低，且患者多以手术干预为主，借助手术能切除病灶组织，多数患者可从中获益。但是，部分患者术后区域性淋巴结转移发生率较高，成为影响患者手术预后及生存的重要原因之一［12］。Marina 等［13］研究表明：由于分化型甲状腺癌患者病灶组织分化良好，能合成与分泌Tg、TgAb。通过测定Tg、TgAb 能反映患者术后恢复情况，亦可实现术后转移监测。但是，Tg、TgAb 临床使用时常可以相互影响，临床上尚缺乏排除二者影响的方法。国外学者研究表明：Tg、TgAb 用于分化型甲状腺癌患者难以动态反映患者的病情，导致临床使用受到限制［14］。

微小RNA 是机体内源性表达的非编码小分子单链RNA，缺乏阅读框，难以编码任何蛋白，但是具有高度的保守性、组织特异性及时序性。目前，临床上已经鉴定出miRNA 合计8 000 多种，能调节真菌、植物、动物等发育［15］。Renaud 等［16］研究表明：miRNA 的保守性进化有助于在基因转录后调控生长发育过程，可通过与靶基因特异性结合参与疾病的发生、发展。本研究中，两组TSH、FT3、FT4 水平比较差异无统计意义；转移组miR⁃194⁃5p、Tg 及TgAb 水平高于非转移组，从本研究结果看出，miR⁃194⁃5p在分化型甲状腺癌患者中呈高表达，能参与分化型甲状腺癌的调控与转归。吴彩娓等［17］研究证实，microRNA 能参与机体细胞的增殖、凋亡、免疫应答、生长发育、肿瘤的发生过程，microRNA 介导的转录后基因沉默与肿瘤形成的关系为当前研究的热点。miR⁃194 小家族包括miR⁃194a 和miR⁃194b 两个成员，二者在3′端存在两个核苷酸区别。miR⁃194能作用于RIG⁃I 通路及TLRs/MyD88/NF⁃kB 等信号通路，并对通路中的细胞炎性因子进行调节，从而负向调节固有免疫的强度［18］。本研究ROC 曲线结果表明miR⁃194⁃5p联合甲状腺功能指标能提高分化型甲状腺癌患者术后转移预测效能。郭琪等［19］研究表明：miR⁃194⁃5p与甲状腺癌存在紧密的联系，能参与甲状腺癌的发生、发展和转归，亦可实现甲状腺良恶性结节的区分和鉴别。而在分化型甲状腺癌患者中，miR⁃194⁃5p能通过调控靶基因的表达及相关信号通路，参与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移及凋亡等生物学过程。本研究Pearson 相关性分析结果看出分化型甲状腺癌患者手术后，加强患者miR⁃194⁃5p水平测定，了解患者术后甲状腺水平，或可预测患者术后转移，对于检测异常者应尽早采取干预措施，巩固手术效果，延长患者生存期。

综上所述，miR⁃194⁃5p在分化型甲状腺癌患者中呈高表达，对患者术后转移可能具有较高的预测灵敏度及特异度，且与Tg 及TgAb 水平存在正相关。