数字PCR法检测血液EGFR基因T790M突变的评价

曲守方 徐任 张文新 黄传峰★ 黄杰★

肺癌是全球癌症死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）占85%［1］。NSCLC 患者中存在多种肿瘤基因突变类型，表皮生长因子受体（epidermal growth factor re⁃ceptor，EGFR）基因是目前NSCLC 治疗最重要的分子靶点。针对NSCLC 的靶向治疗进展迅速，已获批准的表皮生长因子受体（epidermal growth fac⁃tor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine ki⁃nase inhibitors，TKIs）药物，包括吉非替尼（Gefi⁃tinib）、阿法替尼（Afatinib）和甲磺酸奥希替尼（Osimertinib）等［2⁃3］。NSCLC 患者通常在接受一或二代TKI 靶向治疗后9～14 个月时会发生获得性耐药，EGFR基因第20 号外显子发生的T790M 突变是最常见的获得性耐药［4⁃5］。美国国立综合癌症网 络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）发布的非小细胞肺癌（NSCLC）的临床实践指南指出，患者需进行EGFR基因突变检测。

国内有多家公司开展不同方法的血浆EGFR基因T790M 突变检测试剂盒的研发。中国食品药品检定研究院研制了血浆循环肿瘤DNA 基因突变检测国家参考品，包括EGFR基因点突变、缺失突变和扩增突变等类型［6］。本研究使用国家参考品，对EGFR基因T790M 突变检测试剂盒（数字PCR 法）的准确性、特异性和检测限进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血浆

ctDNAKRAS/ NRAS/ EGFR/ BRAF/MET基因突变检测国家参考品，由中国食品药品检定研究院（简称中检院）提供。

1.1.2 试剂

人EGFR基因T790M 突变检测试剂盒（数字PCR 法）和核酸提取及纯化试剂，上海源奇生物医药科技有限公司提供；微滴生成油，购自美国伯乐公司。

1.1.3 仪器

NanoDrop 紫外可见分光光度计，型号：2000c，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；微滴式数字PCR 系统，型号：QX200，美国BIO RAD 公司；全自动样本处理系统，型号：JT⁃DGR⁃001，生物芯片阅读仪，型号：JT⁃Scan⁃001，长春技特生物技术有限公司。

1.2 方法

按照试剂盒说明书进行操作，使用核酸提取及纯化试剂提取EGFR基因T790M 突变的国家参考品（T790M 突变频率分别为3%，1%，0.3%，0.1%和0.05%）的血浆游离DNA，使用NanoDrop分光光度计进行样本浓度测定。然后根据试剂盒的检测限要求将0.05%突变频率的EGFR基因T790M 突变的检测限样本稀释至2 ng/μL。取不同突变频率EGFR基因T790M 突变的游离DNA样本6 μL，加 入14 μL PCR 预混液（ddPCR 和ddPCR MIX3）中。混匀后使用全自动样本处理系统进行微滴制备。将微滴转入96 孔板内后，使用微滴式数字PCR 系统的封膜仪和PCR 仪进行封膜和PCR 扩增，程序：95℃10 min；（94℃15 sec，58℃60 sec），40 个循环；98℃10 min；4℃5 min。取PCR 扩增样本，加至试剂盒的芯片中，使用生物芯片阅读仪读取结果。采用QuantaSofrt 软件分析，3 个及以上微滴出现在FAM 信号的阳性区域（ch1+ch2⁃）时，结果判为EGFR基因T790M 位点突变。计算阳性和阴性微滴的数量及阳性微滴的比例，根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。

2 结果

对于不同突变频率（3%、1%、0.3%和0.1%）EGFR基因T790M 突变的国家参考品样本，样本结果显示Ch1+Ch2⁃区的点数均≥3 个，试剂盒能够准确检出T790M 突变阳性。见表1、图1。对于2 ng/μL 浓度的0.05%突变频率的EGFR基因T790M突变的国家参考品样本，样本结果显示Ch1+Ch2⁃区的点数为3 个，试剂盒能够准确检出T790M 突变阳性。见表1、图2。

图1 试剂盒的检测限的结果［CP_018_05（0.05%）］Figure 1 The limit result of kit［CP_018_05（0.05%）］

图2 试剂盒的准确性结果［（CP_018（3%，1%，0.3%，0.1%）］Figure 2 The accuracy result of kit［CP_018（3%，1%，0.3%，0.1%）］

表1 试剂盒的准确性结果Table 1 The accuracy result of kit

对试剂盒范围外的EGFR基因其他突变样本，如G719S 突变的样本CP_019_01（3%），Ch1+Ch2⁃区的点数为0 个，试剂盒未检出T790M 突变阳性。见图3。

图3 试剂盒的特异性结果（CP_019_01（3%））Figure 3 The specific result of kit（CP_019_01（3%））

3 讨论

EGFR基因位于人类7 号染色体的短臂上，其突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）区域的前四个外显子上（18～21）。EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注。研究显示肿瘤患者的外周血中存在来源于凋亡或者坏死的肿瘤细胞的循环肿瘤DNA（cell tumor DNA，ctDNA），患者血液中可以检测到与肿瘤组织高度一致的肿瘤基因突变。对晚期肺癌患者，在不能获取肺癌组织样本时，可以选择外周血样本进行相关肿瘤基因突变检测。《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》的发布［7］，规范了中国EGFR基因血液检测。血浆EGFR基因突变检测方法包括扩增阻碍突变阻滞扩增系统（amplification refractory mutation sys⁃tem，ARMS）法、二代测序法（next generation se⁃quencing，NGS）和微滴数字聚合酶链反应法（droplet digital polymerase chainaction，ddPCR）等［8⁃10］。目前国家药品监督管理局仅批准了厦门艾德生物医药科技股份有限公司的人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法），用于血浆样本EGFR基因突变的检测。研究报道第三代EGFR⁃TKI 的奥希替尼对出现EGFR基因T790M突变的耐药患者有较好的治疗效果［11］，EGFR基因T790M 突变的检测具有重要的临床指导作用。《中国非小细胞肺癌患者EGFRT790M 基因突变检测专家共识》的发布，对T790M 突变检测进行相应的规范［12］。

为了评价不同方法的肿瘤基因突变检测试剂盒性能，EGFR基因T790M 突变的国家参考品样本设置了不同的突变频率梯度，并使用二代测序法进行验证。国家参考品也提供了阴性血浆样本，可以根据试剂盒的检测限要求用于样本的稀释。本研究结果显示试剂盒对3%～0.1%突变频率的EGFR基因T790M 突变的国家参考品，能够准确检出标示的T790M 突变；对国家参考品中EGFR基因其他突变的样本，如EGFR基因G719S突变，未检出试剂盒范围内的T790M 突变，表明试剂盒具有很好的准确性和特异性。人EGFR基因T790M 突变检测试剂盒（数字PCR 法）可以检测0.05%突变频率的EGFR基因T790M 突变；使用阴性血浆样本对0.1%国家参考品稀释后的样本进行检测限性能评价，试剂盒能够准确检出T790M 突变，表明检测限符合要求。研究结果表明国家参考品可以用于评价数字PCR 法的血浆EGFR基因T790M 突变检测试剂盒的准确性、特异性和检测限，拓宽了其检测方法的适用性。