ASFV核酸防污染恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

陈雪蓉，徐 林，王远微，汤 承，岳 华*

（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州动物疫病预防控制中心，四川 康定 626000）

非洲猪瘟（ASF）是非洲猪瘟病毒（ASFV）感染猪引发的一种急性、热性、高度接触性、致猪高死亡率的传染性疾病，典型临床症状是皮肤泛红、高热、腹泻和出血［1-2］。由于ASF 的临床症状很难与古典猪瘟（CSF）和猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）区分开，使得ASF 难以准确诊断，还需通过实验室检测来确诊。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA 复制，具有特异性强、灵敏度高、简便快速等特点，被广泛应用于ASFV检测中。但由于PCR较高的灵敏度，使其易受污染而出现假阳性结果，进而严重影响PCR检测的准确性。

随着技术的不断发展，检测方法的灵敏度越来越高，造成污染的风险也越来越高，造成PCR污染的主要污染源是扩增产物和阳性对照物。由于拷贝数量极大，在PCR扩增时的开盖、摇动、吸样过程中与空气接触形成气溶胶体，污染空气、试剂、移液器以及操作人员的手套衣物，使阴性对照反复出现污染，造成检测无法正常进行。

1 材料

1.1 临床样本 猪细小病毒（PPV）WH-1 株、猪瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GDr 株、猪源伪狂犬病毒（PRV）Bartha-k61 株、猪源乙脑病毒（JEV）SA14-14-2株，均购自中国兽医药品监察所；猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株swun620、非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸，由西南民族大学动物医学实验室提供，用于特异性评价。

51 份ASFV 阳性样本及49 份ASFV 阴性样本的核酸均由西南民族大学动物医学实验室（四川省ASF 定点检测实验室）提供，用于检测方法的比较。

1.2 主要试剂 pMD19-T 克隆载体，DH5α感受态细胞，DL500 DNA Marker，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR Mix.with UNG），Gel Extraction Kit胶回收试剂盒，PetNAD核酸萃取试剂盒。

1.3 主要仪器 移液器，核酸蛋白分析仪，电泳仪及凝胶成像系统，荧光定量PCR 仪，小型离心机，POCKIT Micro Plus核酸八通道分析仪。

2 方法

2.1 引物、探针的合成 基于农业农村部公告第172 号推荐的荧光定量PCR 方法的引物和探针能满足iiPCR 方法对引物和探针的要求，所以本研究采用该方法的引物和探针，扩增片段长度为63 bp，引物序列为F：5′-CCTCGGCGAGCGCTT TATCAC-3′，R：5′-GGAAACTCATTCACCAAATC CTT-3′；探针序列为5′-FAM-CGATGCAAGCTTT AT-MGB-3′。引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 样本处理

2.2.1 猪组织 对每种组织分别取样和处理，取不少于2.0 g 组织，研磨后用5 倍体积灭菌PBS 悬浮，70 ℃灭活30 min，4 ℃下离心10 min，取上清液进行核酸提取。

2.2.2 猪全血 直接取相应量的全血进行核酸提取。

2.3 核酸提取 用于特异性检验的毒株均采用酚-氯仿-异戊醇法和Trizol 法提取DNA 和RNA。DNA 于－20 ℃保存备用，RNA 反转录成cDNA保存于－20 ℃备用。

2.4 ASFV阳性标准品的制备 采用前述引物以ASFV 阳性DNA 为模板进行常规PCR 扩增，PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，目的条带用Gel Extraction Kit 胶回收试剂盒回收并连接到pMD19-T载体上，随后转化DH5ɑ感受态细胞，阳性克隆并提取质粒，将测序正确的阳性质粒作为本研究的阳性标准品，用核酸蛋白分析仪测定其浓度（μg/mL），按照下述公式换算成拷贝/μL：

阳性标准品浓度（拷贝/μL）＝阳性标准品浓度×10-9×6.02×1023/（660×质粒总长度）

2.5 反应体系的优化 参考沈思思［3］的研究，采用50 μL 反应体系，对体系中的上下游引物浓度10 μmol/μL（0.5～5 μL）、荧光探针浓度10 μmol/μL（0.05～0.5 μL）、含UNG的Taq预混酶5 U/μL（22～28 μL）进行优化。以iiPCR仪器内存卡中检测前读取的荧光值（A520）与检测后读取的荧光值（B520）的比值R来判定，取比值R最大时的相应体系为最优体系。

2.6 特异性评价 用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法对PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸样本进行检测，并设ASFV阳性标准品为阳性对照，阴性对照的模板用等量去离子水代替，以评价ASFV iiPCR方法的特异性。

2.7 灵敏度测定 将阳性标准品梯度稀释（10n～100）后作为模板，阴性对照的模板用等量去离子水代替，测定本研究建立的ASFV 防污染iiPCR方法的检测下限。

2.8 稳定性验证 用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法对6 个稀释度的ASFV 重组质粒标准品进行检测，每个浓度设3个复孔，评价其批内重复性；同时以这些阳性标准品为模板，每间隔一天进行3次独立检测，检测其批间重复性。

2.9 临床样本检出情况的比较 采用本研究建立的iiPCR 和农业农村部172 号公告推荐的荧光定量PCR 方法同时对51 份ASFV 阳性样本核酸及49 份ASFV 阴性样本核酸进行检测，统计并比较两种检测方法对ASFV的检出情况。

3 结果

3.1 优化后的ASFV防污染iiPCR反应体系 UNG酶防污染iiPCR反应体系的总量为50 μL，优化后的体系见表1。

表1 优化后的防污染iiPCR反应体系

3.2 防污染iiPCR 的特异性 如图1 所示，用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法从ASFV 阳性核酸样本中扩增出63 bp 的目的片段，而对PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的检测结果均为阴性，表明该检测方法的特异性良好。

图1 防污染iiPCR检测及其产物的电泳结果

3.3 防污染iiPCR 的灵敏性 用核酸蛋白分析仪测定ASFV阳性标准品的浓度为176 μg/mL，代入公式换算核酸浓度为2.55×1012拷贝/μL。对标准品进行倍比稀释后（2.55×1011～2.55×100），检测结果显示iiPCR 方法对ASFV 核酸的最低检测限为25.5拷贝/μL。

3.4 防污染iiPCR 的稳定性 试验结果显示该方法的批内变异系数为0.86%～2.22%，批间变异系数为1.66%～3.82%（表2）。6个梯度的变异系数均小于5%，表明建立的ASFV 防污染iiPCR 方法在批内和批间都具有较好的稳定性。

表2 防污染iiPCR的稳定性

3.5 防污染iiPCR 的效果验证 UNG-ASFV DNA 阳性模板的浓度为6.08×1010拷贝/μL，将阳性模板梯度稀释后作为模板（阴性对照的模板用等量去离子水代替），在37 ℃条件下作用10 min，再根据最优体系来进行iiPCR 扩增，检测结果显示：本研究建立的防污染ASFV iiPCR 可以有效消除6.08×105拷贝/μL 的扩增产物，表明UNG 酶可以有效防止污染，且UNG酶在PCR预变性解链时失活，不会影响PCR后续反应。

3.6 临床样本检测结果的比较 本研究建立的防污染iiPCR与传统荧光PCR检测的符合率见表3。从表3 可见，本研究建立的iiPCR 方法和农业农村部推荐方法对ASFV阳性样本和阴性样本的核酸检测结果一一对应，完全一致，表明本研究建立的防污染iiPCR检测方法准确可靠。

表3 两种方法对ASFV检测结果的比较

4 讨论

4.1 ASFV防污染iiPCR方法的优势 恒温隔绝式荧光PCR（iiPCR）是一种基于Rayleigh-Benard对流原理设计的新型荧光PCR技术，该方法对于DNA 和RNA 的检测都具有极好的灵敏度和特异性［3］。与实时荧光定量PCR 检测技术，需要琼脂糖凝胶电泳鉴定的传统PCR 或热循环式PCR 不同的是，该技术实现了核酸分析仪的小型化。本研究基于UNG 酶的生物学特性，在iiPCR 反应体系中引入UNG 酶，对反应体系进行优化，建立了防污染的ASFV iiPCR 检测方法。该方法对实验室环境及操作人员的要求不严格，对PCR反应的反应性、便捷性和时效性无影响，也不影响后续实验，同时可以解决阳性对照物及扩增产物对PCR扩增体系污染的问题，降低假阳性的出现概率，提高检测方法的可靠性。

Biagetti 等［4］在2018 年建立了加入UNG 酶的基于嵌合DNA/LNA 的生物传感器用于检测非洲猪瘟病毒的方法，该方法在病毒载量较低时，检测灵敏度显著降低［5］。本研究用dUTP 取代dTTP，对ASFV 基因组DNA 进行扩增，得到大量含尿嘧啶的U-DNA，将其作为后续实验的阳性模板。进行PCR 反应前在反应体系中引入UNG酶，对UNG 酶的用量和反应时间进行优化。UNG 酶可将污染的含尿嘧啶的U-DNA 水解产生脱嘌呤嘧啶位点，失去模板的功能，而UNG 在预变性过程中被灭活而不影响PCR 扩增。结果表明，即使高浓度的U-DNA 污染PCR 反应体系，也可以有效防止污染，而且对PCR 扩增无影响。本方法不仅能快速地消除污染，且上机检测时间仅需42 min，检测速度更快，操作更简捷，对实验室环境和操作人员的要求不高，能够有效提高ASFV PCR 检测的准确性，防止假阳性的出现，为ASFV 的现场检测提供了一种可靠的防污染方法。

4.2 基于UNG酶的防污染PCR方法的优势 为了防止PCR 污染，很多技术方法被应用，主要有物理隔绝法，紫外照射法，酶消化法，化学修饰法，DEAE 纤维素法等，但是这些方法费时费力，且效果不理想。物理隔绝法是将PCR 实验室分为四个区域，实验严格单向进行（试剂准备区、样本制备区、核酸扩增区、产物检测区），防止杂质对试剂、样本的污染，但还是无法避免因气溶胶产生的污染。紫外照射法操作较简单且成本低，但所需时间较长。Glushkov 等［6］发现DEAE法最高能将污染降低106 倍，但是此方法操作过程较为繁琐，所需时间较长。

UNG 是一种DNA 修复酶，能识别并去除DNA 中的尿嘧啶，将试剂中的dNTP 替换成dUTP，在高温条件下发生断裂，在预变性过程中UNG 被灭活而不影响后续PCR 扩增［7］。在PCR混合试剂中加入UNG，每次扩展前在37 ℃下作用10 min 左右就能消化可能存在的污染产物，然后进行PCR 扩增，整个过程也是无需开管，不会再次污染。这种防污染手段所需时间较少，操作简单，因此利用该酶的这种特性建立的防污染方法在一些病原检测中得到了广泛应用［8］。