一例猪圆环病毒2型和3型混合感染的实验室诊断

拉马甲甲，文建华，徐志文*

（1.四川省喜德县农业农村局，四川 喜德 616750；2.四川农业大学动物医学院，动物疾病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130）

猪圆环病毒（PCV）是一种单股负链共价闭合环状DNA 病毒，属圆环病毒科、圆环病毒属［1］。目前全球已报道的共有4 种血清型，我国国内主要流行2型和3型，其中PCV 2型对猪群的传染性和致病性最强，存在垂直传播。猪圆环病毒2 型在国内最早于2001 年在京津冀地区的猪群中被分离鉴定［2］，猪圆环病毒3 型则由华南农业大学宋长绪教授课题组于2017 年首次在国内发现［3］。目前关于PCV3 的症状与致病性的相关研究还在进行，但已有报道显示在出现繁殖障碍、免疫抑制、多器官炎症及猪皮炎与肾病综合征（PDNS）的猪群中曾检测出PCV3病原。

1 材料与方法

1.1 病料 病料采集于出现喘气、发烧以及多器官功能衰竭的断奶仔猪，主要采集肺脏与脾脏。

1.2 试剂 磁珠法总核酸提取试剂盒与配套仪器购买自国生生物技术有限公司；Taq PCR Master Mix、DEPC处理水购买自生工生物公司；DL2000 Marker 与反转录试剂盒（PrimeScrip RT reagent Kit）购买自TAKARA（宝生物有限公司）。

1.3 样品处理 检查样品，确定病变区域，从病变区域边缘剪取并称量样品4 g，装入无菌无DNase的EP管中，加入1 000 μL DEPC处理水，匀浆后置于－40 ℃下反复冻融3次，8 000 r/min离心5 min，取上清液，－80 ℃下储存备用。

1.4 引物合成 根据GenBank 登录的猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪圆环病毒3 型（PCV3）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）的基因序列，利用DNAMAN软件分析保守序列并设计引物，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.5 核酸提取与PCR检测 提取样品总DNA与总RNA，使用PCV2、PCV3、PRV、PPV引物分别对样品总DNA 进行PCR 检测；将总RNA 反转录后取得cDNA，使用PRRSV、CSFV 引物进行PCR 检测。PCR反应体系程序分别见表2、表3。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

2 结果

对样品进行PCR扩增，并对PCR产物进行凝胶电泳检测，结果显示PRV、PRRSV、PPV、CSFV均呈阴性，PCV2 及PCV3 出现阳性条带，其中1、2、3、4 号样品检出PCV2 阳性；1、5 号样品检出PCV3 阳性（结果如图1、图2）。判定1 号样品为猪圆环病毒2型和3型的混合感染。

图1 PCV2 PCR检测结果

图2 PCV3 PCR检测结果

3 讨论

猪圆环病毒2 型与3 型的混合感染在临床上较为常见，二者临床特征相近且均有较为严重的致病性，因此鉴别诊断对于疫病防控尤为重要［4］。

猪圆环病毒2 型主要侵袭胎儿心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞，而在仔猪和成猪上只感染巨噬细胞，造成患病猪只的免疫系统损伤，引发T淋巴细胞和B 淋巴细胞的数量下降，从而导致患病猪免疫抑制。因此，猪群在感染猪圆环病毒后可能会进一步发生其他疫病的并发感染和传播［5］。临床上常见圆环病毒与其他各类细菌病或病毒病的混合感染现象，导致受感染的猪场损失扩大，同时防控难度更大。当猪群中检测出圆环病毒2型或3 型感染或混合感染时，需要同步加强其他病毒病和细菌病的监测力度。

防控时应当注意将病死猪、扑杀猪及其污染物作无害化处理；对发病猪和疑似患病猪隔离单独饲养，并加强其他猪群疫病的防控；加强猪场管理，定期对养殖器具与圈舍进行消杀。需要注意的是，猪圆环病毒对环境有较强的抵抗能力。研究表明，PCV2 在75 ℃下加热15 min 感染活性几乎不变，在80 ℃下加热处理15 min 才会完全丧失感染活性［6］，因此常规的依赖温度变化的消毒方法，如巴氏消毒法、干热消毒法和湿热消毒法对PCV 的杀灭效果相当有限［7］。由于PCV 在结构上不存在囊膜，因此病毒对有机溶剂（氯仿、酒精等）不敏感，而苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和强氧化剂等物质则对PCV 具有较强的抑制效果［8］。此外，猪场应当严格限制无关车辆和人员进出，加强饲养管理，防止外来病原体侵入和猪只应激而导致免疫力下降。