规模化奶牛场血清弓形虫抗体的检测

李青松

（四川省绵阳市经济技术开发区动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 621000）

弓形虫病（Toxoplasmosis）又称弓浆虫病或弓形体病，是一种全球性分布的寄生性人兽共患原虫病［1］。引起该病的刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）属于球虫目弓形虫科弓形虫属。动物感染弓形虫后多表现为高热、呼吸及神经系统症状、流产、死胎等。奶牛感染弓形虫后病程多呈急性经过，表现出发热，乳房炎，体表淋巴结肿大，共济失调和感觉过敏等精神症状，严重者可导致死亡。部分奶牛呈隐性感染，没有明显症状。对死于弓形虫病的奶牛进行剖检，发现血液凝固不全，稀薄如水，头颈部皮肤发生水肿；心脏出现心肌炎病变；各处淋巴结出现不同程度的肿大，尤以肺门淋巴结和肠系膜淋巴结最明显；气管黏膜有出血点；肺脏出现淤血呈绛紫色，切面流出泡沫样液体；肾脏和肝脏表面出现坏死；皱胃黏膜出血、坏死，呈灰黑色，容易剥落；肠道重度充血，肠黏膜上有坏死灶，肠腔内出现大量渗出物。

目前，检测弓形虫病的血清学方法主要是酶联免疫吸附法（ELISA）。该方法主要利用弓形虫特异性抗原来测定宿主体内相应的抗体（IgA、IgM、IgG 和IgE）［2］。而间接酶联免疫吸附法因检测IgG抗体方便快捷、血样用量少、结果较准确等优点而成为目前临床上检测弓形虫病应用最广泛的方法［3］。本试验采集了绵阳和资阳两个规模化奶牛场奶牛的血液样本，通过间接ELISA 方法检测血清中弓形虫的IgG 抗体，以此了解两场奶牛弓形虫的感染情况，为弓形虫病防控提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 IDEXX 弓形虫抗体检测试剂盒（Toxoplasma gondii Antibody Test Kit）购自爱德士元亨生物科技（北京）有限公司。

1.2 样品采集 2019 年8 月从四川省资阳市某规模化奶牛场采集奶牛血液样本171 份，2020 年5月从绵阳市某规模化奶牛场采集奶牛血液样本207 份。每头奶牛无菌颈静脉采血5 mL，血液样本在室温静置30 min 后以3 000 r/min 离心5 min获得血清，将上层血清用移液枪分装至洁净的离心管内，经过统一标记后置于－20 ℃冰箱中保存待检。

1.3 ELISA 检测 根据IDEXX 弓形虫抗体检测试剂盒说明书操作，观察并记录产生颜色变化的反应孔，在450 nm处检测反应孔中样品的吸光度值并记录。用爱德士元亨生物科技（北京）有限公司提供的数据分析软件（xChek）处理数据，根据试剂盒说明书的计算方法计算结果，并以结果判定标准为依据进行结果判定。

1.4 复检 经判定后，将结果为可疑的血清样品重复上述ELISA步骤再次检测。

1.5 数据分析 应用SPSS 22.0 软件，采用卡方检验对试验数据进行生物学统计分析，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 血液样本数量 本试验共采集资阳市某规模化奶牛场171 份血液样本，其中7 份血液样本在运输过程中发生明显溶血，3 份血液样本体积过少，故待检测血清样本仅161份；共采集绵阳市某规模化奶牛场207 份血液样本，其中3 份血液样本在运输过程中发生明显溶血，2 份血液样本体积过少，故待检测血清样本只有202 份。两个规模化奶牛场的血液样本共计363份。

2.2 资阳市奶牛场弓形虫病血清学检测结果 经过初次检测，呈弱阳性的血清样本有10 份，呈阴性的血清样本有142 份，另有9 份血清的检测结果可疑。可疑样品经重复检测后，其中2份检测结果转为弱阳性，4 份为阴性，剩余3 份仍为可疑。故该养殖场检测结果显示呈弱阳性的血清样品有12份，阳性率为7.45%（12/161），呈阴性的血清样本有146 份，阴性率为90.68%（146/161）。结果详见表1。

表1 资阳市奶牛场弓形虫病血清学检测结果

2.3 绵阳市奶牛场弓形虫病血清学检测结果 经过初次检测，血清样本中呈弱阳性的有2 份，呈阴性的有192 份，另有8 份检测结果可疑。将可疑样品进行重复检测，结果其中4 份转为阴性，剩余4份仍为可疑。故该养殖场的检测结果显示呈弱阳性的血清样品有2 份，阳性率为0.99%（2/202），呈阴性的血清样品有196 份，阴性率为97.03%（196/202）。结果详见表2。

表2 绵阳市奶牛场弓形虫病血清学检测结果

2.4 两个奶牛场弓形虫病血清学检测结果统计分析 本试验通过间接ELISA 检测了四川省资阳市某规模化奶牛场的161 份血清样本和绵阳市某规模化奶牛场的202 份血清样本中的弓形虫IgG 抗体，并利用卡方检验比较两者阳性率是否存在显著差异（表3）。从表3 可知，资阳养殖场的阳性率为7.45%（12/161），绵阳养殖场的阳性率为0.99%（2/202），两场阳性率差异显著（P＜0.05）。

表3 两个奶牛场弓形虫病血清学检测结果比较

3 讨论

3.1 两个规模化养殖场奶牛弓形虫病血清学结果分析 本次试验共检测奶牛血清样本363 份，检出14 份阳性血清，总阳性率为3.86%。其中，阳性率较高的是资阳奶牛场，为7.45%（10/161）。该结果高于2020 年叶勇刚等［4］对四川部分地区奶牛弓形虫阳性率的调查结果（4.59%），同时也高于郑州市（5.38%）［5］和辽宁省（6.0%）［6］的研究结果。分析造成这个结果的原因可能有以下几方面：首先，该养殖场周围可能存在患有弓形虫病的流浪猫，作为弓形虫终末宿主的流浪猫一旦进入养殖场，猫粪中排出的卵囊就会污染奶牛的饲料、饮水或食具等，而这些均可成为奶牛感染的重要来源［7］；其次，资阳地区气候和地理条件更利于弓形虫卵囊在外界长时间的存活，这与Sarvi［8］等报道的“温暖多雨的埃及和阿富汗等国家牛弓形虫的感染率远远高于伊朗”相似；最后，该场对弓形虫病的防控措施不当，员工对奶牛弓形虫感染的重视不足。虽然该场的弓形虫阳性率较高，但是采样时未发现有典型症状的奶牛，分析原因可能是感染奶牛为隐性感染，没有明显症状；其次血液样品在冰箱中储藏时间过久而导致假阳性结果等。

绵阳奶牛场阳性率为0.99%（2/202），不仅低于2020 年叶勇刚等［4］的研究结果，也低于广西省（9.2%）和黑龙江省（11.7%）［6］的研究结果。这可能得益于该奶牛场对弓形虫的防治较为重视，实行了较为严格的弓形虫病防治措施，如对疑似患病牛及时隔离，并严格消毒等。

本试验中两个奶牛场的阳性率差异显著（P＜0.05），分析原因可能与奶牛场地理位置和饲养管理模式不同有关，而具体因素（如弓形虫防治措施，养殖场是否有流浪猫出入，奶牛饲料和饮水来源，养殖密度，引种历史等）仍待进一步研究。

3.2 ELISA 试验可疑结果分析 本试验共检测奶牛血清样本363份，初检时有17份检测结果可疑，经复检后，其中2 份转为弱阳性，8 份转为阴性，剩余7 份仍为可疑。造成复检后可疑样品结果改变的原因可能有以下几方面：第一是样品溶血，该ELISA法运用HRP标记IgG抗体，由于溶血时会释放Hb，其具有的高过氧化物酶活性会产生非特异性显色，同时发生溶血的血清颜色加深，也会致使测得的吸光度值增高，干扰结果的准确性；第二是细菌污染样品，本试验运用的酶标是HRP，该酶可能存在于污染样品的细菌的菌体内，从而导致非特异性显色，干扰结果的准确性；第三是样本保存不当，样品若置于外界超过1 d，会导致血清中的抗体免疫活性减弱而呈现假阴性结果，样品置于冰箱的时间过久，在采用间接ELISA 检测时由于血清中IgG抗体聚合形成多聚体，容易导致假阳性；第四是初检过程中部分操作不规范，如洗涤时洗涤液过少或过多，洗涤液未与反应孔充分接触而使孔壁洗涤不干净，加样时加样速度过快而产生气泡等［9-12］。复检后仍有7 份样品的结果为可疑，对此应该前往该奶牛场再次采样并检测。检测时需严格按照弓形虫抗体检测试剂盒的说明书操作，也可以采用其他血清学方法进行辅助检测，以增加检测的特异性和敏感性，使检测结果更加可靠。

3.3 奶牛弓形虫病防治建议

3.3.1 请专业人员对奶牛场工作人员进行弓形虫病防治培训，根据实际情况制定规范合理的弓形虫防治方案并严格执行。

3.3.2 定期随机挑选不同圈舍的奶牛进行弓形虫病检测，一旦发现阳性奶牛，第一时间隔离治疗，将阳性奶牛产生的排泄物及时处理，接触物及时消毒，人员要做好个人防护，防止感染。同时，根据实际情况淘汰病牛，并对其他健康奶牛群进行药物预防［13］。

3.3.3 定期打扫和消毒奶牛场，奶牛场内的排泄物应及时清理并进行无害化处理。可用55 ℃以上的热水对已经污染的地方消毒［14］；消毒剂种类也需要定期更换。

3.3.4 死于或疑似死于弓形虫病的奶牛尸体，应该烧毁或深埋。

3.3.5 坚持自繁自养，若要引种应提前对引进的奶牛进行血清学或病原学检测，严禁引进弓形虫病阳性奶牛，防止感染场内其他健康奶牛。

3.3.6 在养殖场及其周围严禁养猫，并防止猫进入养殖场，严防奶牛的饲料和饮水接触猫粪。

3.3.7 磺胺类药物是治疗奶牛弓形虫病的首选药，在发病初期及时用药疗效较好［15］。