基于GC-MS非靶向代谢组学分析贵州 特色蜂蜜的代谢物差异

姚丹，李应，黎华君，于瀛龙，贺兴江，詹洪平，周文才，万炜，韦小平

（贵州省农业科学院现代农业发展研究所，贵州贵阳 550006）

蜂蜜作为主要的蜂产品之一，按照植物来源可分为单花蜜和多花蜜，其所含的化学成分多样性与植物源密不可分[1,2]。蜂蜜中除大量葡萄糖、果糖等碳水化合物和水分外，还含有少量活性物质，包括氨基酸、酶类、黄酮类、矿物质等[3,4]。由于不同蜜源植物分泌的小分子萜类、黄酮类、酚酸类等次生代谢产物及矿物质成分存在差异，使得不同种类蜂蜜的口感、功效存在差异[5]。目前，检测蜂蜜中活性物质含量、糖类理化指标是鉴定蜂蜜品种和品质的重要手段[6-8]。糖类和活性物质是蜂蜜在维持血糖和血脂正常水平、抗氧化等方面发挥作用的原因[9-11]。

非靶向代谢组学（Untargeted metabolomics）是目前最为常用的代谢组学研究手段，通过液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、气相色谱-质谱联用（Gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）等技术手段来筛选待测样品中已知和未知代谢物的定量信息，来对生物现象进行总体认识[12-14]。近年来这一技术被广泛应用于鉴定食品品质及产地、掺假掺杂等溯源工作中[15]。陈志燕等[16]采用GC-MS技术鉴定了枇杷蜜、益母草蜜等5种蜂蜜中共25种代谢物，其中枇杷蜜中糠醛含量最高，益母草蜜中油酸乙酯含量最高；孙雨安等[17]采用基于顶空固相微萃取GC-MS分析了7种蜂蜜中44种共有代谢物，主要成分脱氢芳樟醇的含量为6.86×10-3～1222.70×10-3μg/g。粟有志等[18]采用SPME-GC-MS检测新疆地区沙枣蜜、棉花蜜等4种单花蜜，检出144种代谢物，其中芳樟醇、2-(1,1-二甲基)-环己醇和联苯为沙枣蜜的特征性成分，3-苯基丙烯醛、3-苯基-2-丙烯醇为棉花蜜的特征性成分。Jandrić等[19]研究了澳大利亚不同产地来源的蜂蜜，其单氯和多氯在蜂蜜之间存在差异。Georgios等[20]利用HRMS靶向和非靶向代谢组学对10种蜂蜜的酚类化合物分析，筛选出16个差异代谢物，其中脱落酸在杨梅蜜中含量最高。

我国西南地区是特色蜜源植物野蔷薇和蓝莓的主要生长地区之一。目前关于野蔷薇蜜成分分析的相关文献尚未见报道。贵州省是我国蓝莓的最大种植区，是实现蓝莓蜜商品化生产的唯一省份，前期对蓝莓蜜的研究结果显示，蓝莓蜜的酸度偏高、易结晶，槲皮素、对羟基苯甲酸含量较高[21]，为进一步了解蓝莓蜜的理化性质，还需要对蓝莓蜜营养成分进一步分析。因此，本研究选择野蔷薇蜜、蓝莓蜜为研究对象，以高品质的荆条蜜、野桂花蜜作为参考，利用GC-MS技术，根据代谢物的功能分类和代谢通路分析，在代谢水平上研究不同特色蜂蜜所含代谢物差异。本研究对丰富鉴别蜂蜜真假、溯源识别有重要意义，为确定特色蜂蜜蓝莓蜜、野蔷薇蜜特征性物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料蓝莓蜜、野蔷薇蜜、荆条蜜、野桂花蜜分别采集自贵州省丹寨县、麻江县、播州区、德江县、息烽县和铜仁市6地区，均为自然成熟封盖中蜂蜂蜜，共13个样本，每个样本3个生物学重复。

1.2 实验试剂与仪器

甲醇（CAS：67-56-1，HPLC级），CNW Technologies；JXFSTPRP-24研磨仪，上海净信科技有限公司；YM-080S超声机，深圳市方奥微电子有限公司；Forma 900 series离心机，Thermo Fisher Scientific；LNG-T98真空浓缩器，太仓市华美生化仪器厂；L-2-氯苯丙氨酸（CAS：103616-89-3，纯度≥98%），上海恒柏生物科技；甲氧胺盐（CAS：593-56-6，纯度：AR），TCI；吡啶（CAS：110-86-1，纯度：HPLC级），Adamas；DHG-9023A烘箱，上海一恒科学仪器有限公司；氯仿（CAS：67-66-3，HPLC级），Adamas；Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪（配有Agilent DB-5MS毛细管柱），J&W Scientific，Folsom，CA，USA。

1.3 实验方法

1.3.1 代谢物提取

取10 mg蜂蜜样本于2 mL EP管，加入1000 μL预冷的甲醇提取液，涡旋30 s；35 Hz研磨仪处理4 min，冰水浴超声10 min，将样本4 ℃ 12000 r/min离心15 min，取50 μL上清液于1.5 mL EP管中，每个蜂蜜样本各取30 μL混合成QC样本，在真空浓缩器中干燥，加入5 μL内标L-2-氯苯丙氨酸继续干燥，之后向干燥好的代谢物中加入100 μL甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐溶于20 mg/mL吡啶），轻摇混匀并放入80 ℃烘箱孵育30 min，后在每个蜂蜜样品中加入100 μL BSTFA（含有1% TMCS，V/V）、混匀，于70 ℃孵育1.5 h，冷却至室温（25 ℃左右），向混合的样本中加入5 μL FAMEs并溶于氯仿，随机上机检测。

1.3.2 上机检测

Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪配有Agilent DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），GC-TOF-MS具体分析条件为：以无分流模式注入1 μL等份蜂蜜样本，氦气用作载气，前部入口流量为3 mL/min，通过色谱柱的气体流速为1 mL/min。初始温度为50 ℃并保持1 min，然后以10 ℃/min的速率升高至310 ℃，310 ℃恒温保持8 min。注入、传输线和离子源温度分别为280 ℃、280 ℃和250 ℃。电离电压为-70 eV，在溶剂延迟6.25 min后，以每秒12.5个光谱的速率在m/z范围为50～500的全扫描模式下测定蜂蜜样本质谱数据。

1.3.3 数据分析

使用ChromaTOF软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析[22]。对物质定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。最后，将QC样本中检出率50%以下或RSD＞30%的峰去除[23]。使用Heatmap R R[24,25]包对测定的代谢物作聚类热图；蓝莓蜜、野蔷薇蜜、荆条蜜、野桂花蜜四种蜂蜜之间两者间根据差异倍数、t检验的p值和OPLS-DA模型获得的变量重要性投影（variable importance in project，VIP）评分，将VIP＞1，FC＞1、pvalue＜0.05的代谢物定义为差异代谢物（significant changed metabolites，SCMs），同时将得到的相应差异代谢物通过代谢通路数据库KEGG Pathways（KEGG,www.genome.jp/kegg）进行注释。

2 结果与讨论

2.1 四种蜂蜜GC-MS数据质量、PCA分析和重复性评估

QC样本TIC出峰保留时间、峰面积都重叠良好；内标在QC样品中峰面RSD≤30%，其相对标准偏差为11.66%；QC样本相关性≥0.9，显示本次系统稳定性、实验方法、样本质量均为良好，数据质量良好，可作进一步分析。

蓝莓蜜、野蔷薇蜜、荆条蜜、野桂花蜜4种蜂蜜的主成分分析中，第1主成分占58.71%，第2主成分占37.17%，总和为95.88%，第1、2主成分已包含不同蜂蜜的大部分物质信息（图1a）。重复性评估采用斯皮尔曼等级相关系数 r（Spearman Rank Correlation），同一样本的3个生物学重复样本的斯皮尔曼等级相关系数r2≥0.9，重复性良好，不同样本之间样本相关性不高（图1b）。

图1 样本组内、组间PCA分析及相关性图 Fig.1 PCA and correlation diagram within and between sample groups

2.2 四种蜂蜜的代谢物功能注释

2.2.1 KEGG数据库注释

由于蜂蜜中所含成分包含植物分泌的代谢物、蜜蜂加工过程的代谢物以及其它物质，因此，本次KEGG数据库注释选用的是所有物种数据库进行注释。其注释结果显示，本次所鉴定到的90个代谢物（见表1）在pathway level 2条目的top 20注释信息绘图以及注释（图2）。孙雨安等[17]分析的7种蜂蜜中共有的化合物仅有44种；Jose等[5]测定不同单花蜜中的氨基酸、蛋白质、总酚含量，含量差异使得不同蜂蜜在抗氧化、抑菌等方面存在差异。本次鉴定到的90个代谢物分别富集到了总览，碳水化合物代谢和膜运输等模块相关的210条信号通路上，其中总览模块有次级代谢物的生物合成（16个）、脂肪酸代谢（16个）、氨基酸的生物合成（16个）等9条通路；碳水化合物代谢模块有肌醇磷酸代谢（10个）、氨基糖和核苷酸糖代谢（7个）、丙酮酸代谢（7个）等8条通路；膜运输模块有3条信号通路，分别为ABC运输（7个）、磷酸转移酶系统（PTS）（7个）、细菌分泌系统（7个）。对改善机体消化的重要物质进一步分析，消化系统模块中脂肪消化与吸收（5个）、蛋白质消化与吸收（5个）等通路上有代谢物富集。综上，蜂蜜中的所含的物质较为丰富，且所含的代谢物与物质代谢、氨基酸及其他有机物代谢密切相关。

图2 KO pathway level 2条目top20注释信息绘图以及注释 Fig.2 KO pathway level 2 entry top20 annotation information drawing and annotation

表1 代谢物名称、分子量、保留时间、定性离子等信息 Table 1 Metabolite name, retention time, qualifier ion and other information

续表1

续表1

去甲肾上腺素（NE；ID：meta_159）同时富集在唾液分泌（1个）、胃酸分泌（1个）等通路；其中在内分泌系统模块中NE、葡萄糖-1-磷酸（ID：meta_133）

同时富集到卵巢类固醇生成、雌激素信号通路、催产素信号通路等通路。Yu等[26]表明了儿茶酚胺类激素会影响微生物组、营养吸收及肠道固有的免疫系统；NE是天然的儿茶酚胺类激素，是Fe的载体，可促进体外微生物的生长、代谢，营养状况和生物膜形成[27-29]。本次测定4种蜂蜜均检出NE，这可能是蜂蜜能治疗腹泻和美容养颜的原因之一。并且NE富集到唾液分泌、胃酸分泌通路上，因此NE很可能是蜜蜂在蜂蜜酿造这一过程中分泌产生，这有待于进一步验证，以作为真假蜂蜜判别的重要依据。

2.2.2 HMDB（Human Metabolome Database）数据库注释

HMDB数据库注释结果显示，代谢物分别归类到酚类（1个）、非金属氧阴离子化合物（1个）、脂肪酰基（1个）、羧酸及其衍生物（2个）、有机氧化合物（5个）、吡啶及其衍生物（1个）6个分类。其中NE归类到酚类上；麦芽糖（maltose；ID：meta_184）、海藻糖（trehalose；ID：meta_182）、葡萄糖-1-磷酸、肌醇（inositol；ID：meta_156）归类到有机氧化合物上。说明蜂蜜中的酚类、有机氧化物等与人体代谢密切相关。

图3 Top 20 class绘图结果以及注释 Fig.3 Top 20 class drawing results and comments

2.2.3 差异代谢物分析

2.2.3.1 OPLS-DA分析

利用差异分组的正交偏最小二乘法判别分析（ orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA），R（3.3.2）软件包ropls计算的OPLS-DA模型得分显示各组间R2X＞0.68、R2Y＞0.59、Q2Y都在0.50左右，认为是有效的模型（图4a～f）。

图4 OPLS-DA得分图 Fig.4 OPLS-DA score chart

2.2.3.2 差异代谢物Veen分析

在不同蜂蜜样本之间，共检测出差异代谢物12种（图5）。荆条蜜相比于蓝莓蜜差异代谢物有4种，分别为2-酮丁酸（ID：meta_43）、分析物407（ID：meta_170）、脯氨酸（ID：meta_79）、麦芽糖，其中2-酮丁酸下调表达，其它物质上调表达。野蔷薇蜜相比于蓝莓蜜的差异代谢物有3个，分别为2-酮丁酸、分析物389（ID：meta_160）、硬脂酸（ID：meta_163）均为下调表达。Alissandrakis等[30]认为所检测同一样本单花蜜都存在某一化合物，在其它蜂蜜该化合物不存在或含量较少时，此化合物是该单花蜜的特征性物质。经过两两蜂蜜比较后的结果，在蓝莓蜜中2-酮丁酸的含量显著高于其它3种蜂蜜的含量，2-酮丁酸可初步确定为蓝莓蜜中所含，目前，2-酮丁酸应用于食品添加剂的中文名称为2-氧代丁酸，主要用于天然香味料。

图5 不同组别的差异代谢物Veen图 Fig.5 Veen diagram of different metabolites in different groups

野桂花蜜相比于蓝莓蜜差异代谢物有6种，分别为肌醇（meta_156）、分析物407（meta_170）、乳糖2（meta_174）、乳果糖1（meta_175）、海藻糖（meta_182）、麦芽糖。除麦芽糖以外，其余物质都为下调表达。肌醇可降低胆固醇，在帮助体内脂肪的再分配以及供给脑细胞营养上，扮演重要的角色[31,32]，在蓝莓蜜中硬脂酸、肌醇含量高于其它3种蜂蜜的含量，蓝莓蜜可能在增强免疫力、护肝等效果优于其它3种蜂蜜。

野蔷薇蜜相比于野桂花蜜，检测出1个未知的显著下调表达代谢物，ID为meta_140；野蔷薇蜜与荆条蜜的代谢物比较，未检出差异显著的代谢物。3-己烯二酸开环可得到山梨酸，山梨酸是国际上应用最广泛的防腐剂之一，能有效抑制微生物生长、繁殖[33]。粟有志等[18]认为当某些挥发性物质虽然在所检测的单花蜜中不完全存在，但其出现次数较高，在其他蜂蜜中不存在或存在时含量较低，也应将它确定为单花蜜的特征性物质。本次检测中3-己烯二酸仅存在于野蔷薇蜜中，因此，野蔷薇蜜可能在防止食物发霉、变质方面具有更好效果，以及3-己烯二酸可确定为野蔷薇蜜中所含。

已有研究表明麦芽糖具有排毒养颜，补脾柔肝，促进钙、镁、锌等矿物质吸收的特性；乳果糖被称为肠道益生菌的增生剂，缓解肠道菌群紊乱，促进肠道益生菌繁殖[34]。脯氨酸、麦芽糖、去甲肾上腺素、蔗糖这些物质同时富集到了碳水化合物的吸收与消化、蛋白质消化与吸收、脂肪消化与吸收等信号通路上，这可能是解释蜂蜜具有美容养颜、促进消化吸收的原因之一。上述4种蜂蜜麦芽糖、乳果糖的含量顺序为：野桂花蜜＞荆条蜜＞蓝莓蜜＞野蔷薇蜜，因此，在促进肠道蠕动消化吸收效果强弱顺序可能为野桂花蜜＞荆条蜜＞蓝莓蜜＞野蔷薇蜜。海藻糖可稳定人体细胞的细胞膜，与体内的蛋白质结合来保证皮肤水嫩，减少皱纹和色斑生成[35]；脯氨酸是身体中胶原蛋白和软骨所需的氨基酸，帮助人体合成蛋白质[36]；海藻糖、脯氨酸的含量顺序为：荆条蜜＞野桂花蜜＞蓝莓蜜＞野蔷薇蜜，因此，在促进蛋白质合成、结合效果强弱顺序可能为野桂花蜜＞荆条蜜＞蓝莓蜜＞野蔷薇蜜。

2.2.3.3 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析

蓝莓蜜vs野蔷薇蜜中仅有1个下调差异代谢物硬脂酸，分别富集到脂肪酸生物合成、植物次生代谢产物的生物合成等4条通路上。脂肪酸对于视觉、神经以及肝脏等方面具有重要作用[37,38]，相对于野蔷薇蜜而言，蓝莓蜜可能更有利于明目、保护肝脏等作用。野蔷薇蜜与荆条蜜、野桂花蜜相比，所含的显著差异代谢物，不具有ko富集功能。

研究表明人体对不同蜂蜜中的碳水化合物消化和吸收能力不同，碳水化合物在帮助促进人体内代谢物的消化吸收具有重要作用[39,40]。通过ko富集分析，蓝莓蜜vs荆条蜜组有2个具有富集功能的上调差异代谢物，脯氨酸、麦芽糖分别富集到ABC运输（2个）、代谢途径（2个）、氨酰tRNA生物合成（1）等18条通路（表2）。蓝莓蜜vs野桂花蜜组中3个具有富集功能的上调差异代谢物，肌醇、麦芽糖、海藻糖分别富集到代谢途径（3个）、磷酸转移酶系统（2个）、抗坏血酸盐和醛酸盐代谢（1个）等14条通路（表3）。荆条蜜vs野桂花蜜组中4个具有富集功能的下调差异代谢物，蔗糖、肌醇、脯氨酸、海藻糖分别富集在代谢途径（4个）、次级代谢物生物合成（4个）、磷酸转移酶系统（2个）等25条通路（表4）。可见，蜂蜜有助于人体内糖类、脂类物质的代谢及吸收，且不同蜂蜜所含碳水化合物在人体内的吸收和代谢有较大差异，这与Sancheztapia等[39]和Al-Waili等[40]结果一致。

表2 蓝莓蜜vs荆条蜜差异代谢物富集前10 KEGG通路 Table 2 Top 10 KEGG pathways of differential metabolites enrichment between blueberry honey and vitex honey

表4 荆条蜜vs野桂花蜜差异代谢物富集前10 KEGG通路 Table 4 Top 10 KEGG pathways of differentiated metabolites enrichment between vitex honey and wild osmanthus honey

3 结论

本研究基于非靶向代谢组学对4种中蜂蜂蜜进行分析，共检测到2-酮丁酸、海藻糖、肌醇、硬脂酸等12种差异代谢物与糖类、脂类、维生素类物质代谢与吸收密切相关，NE同时存在于4种蜂蜜中，且同时富集在唾液分泌、胃酸分泌、胰腺分泌等信号通路上，未来可作为真假蜂蜜判别的重要依据。其中蓝莓蜜可能在增强免疫、保护肝脏等方面更为突出，更适合作为天然香料添加剂，2-酮丁酸可认为是蓝莓蜜的特征性物质；3-己烯二酸独特存在于野蔷薇蜜中，初步可判定为特征性物质；根据差异代谢物显著程度，本次检测的4种蜂蜜在促进人体消化吸收、帮助蛋白质结合及合成的强弱顺序可能为：野桂花蜜＞荆条蜜＞蓝莓蜜＞野蔷薇蜜。