单粒稻米直链淀粉含量快速测定及其垩白度相关性分析

汪凯骏，张烝彦，章露恒，张孟霜，潘丹杰

（1.杭州市粮食保障服务中心，浙江 杭州 310000；2.杭州市粮食收储有限公司，浙江 杭州 310000）

稻米，亦称大米，是当今世界上最重要的粮油经济作物之一，在我国南方地区大部分人都以稻米作为主食。随着稻米生产规模的扩大以及生活水平的改善，人们对优良食味品质稻米的需求量也将日渐提高[1]。淀粉作为稻米最重要的成分之一，占稻米总重70%～80%。其中，稻米直链淀粉含量的多少与米饭的硬度、黏性以及口味等食味品质有关[2-3]。一般来讲，直链淀粉含量过高的稻米，所蒸煮的稻米偏硬，且黏性也不好，味道较差；相反，含量过低的稻米，所蒸煮的稻米偏软，过于粘连，口感也不好。因此，选择适宜直链淀粉含量的水稻材料作为选种培育的水稻品种就显得尤为重要。

直链淀粉含量作为影响稻米食味品质的主要因素之一，对稻米中直链淀粉含量的检测技术也在进一步发展中。由原来的单波段碘比色法，经过方法改良后扩展为双波段和多波段碘比色法，引入新的检测仪器后，又开发出近红外光谱法（NIR）、热重法（TG）、差示扫描量热法（DSC）等[4-7]测定方法。其中碘比色法为目前实验室中最常见的直链淀粉含量测定法，具备成本低、测定结果准确等优势。在常规选种育种中，用于筛选和鉴别的水稻材料，数量巨大。而参照GB/T 15683—2008《大米直链淀粉含量的测定》的方法测定，过于繁琐、耗费大量的试剂和时间，不利于大批量样品的检测。同时，由于直链淀粉含量是三倍体遗传的特点[8-9]，如果采用混合集中法来分析直链淀粉含量，会导致实验结果与理论值有较大的出入。因此，对于一些围绕稻米蒸煮及食味品质形成机理开展的遗传研究和杂交选育，需要采用单粒米法分析[10]。本文提出了一种可批量化快速测定单粒稻米中直链淀粉含量的方法，并对直链淀粉含量和垩白度这两个影响稻米品质的重要理化指标进行相关性分析，以期为遗传研究和杂交选育提供参考性依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

直链淀粉、支链淀粉标准液（各1 mg/mL，马铃薯来源）：河南省万佳标准物质研发中心有限公司；氢氧化钠（优级纯）：永华化学科技（江苏）有限公司；乙酸（分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；95%乙醇（分析纯）：安徽安特食品股份有限公司；碘、碘化钾（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；试验用的10个稻谷材料来源于浙江杭州、嘉兴地区，分别为粳稻品种：嘉67、秀水121、秀水134，晚籼稻品种：中浙优8号、甬优1540、嘉丰优2号，早籼稻品种：中组143、中组18、中冷23，粳糯稻品种：粳糯4921，分别对应样品编号1～10。

MSA-224S型分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；UV-2600型紫外分光光度计：岛津企业管理(中国）有限公司；ELX-800型全自动定量绘图酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；JNM-III型碾米机：中储粮成都粮食储藏科学研究所；JLG-III型砻谷机：中储粮成都粮食储藏科学研究所；JMWT-12型大米外观品质检测仪：北京东孚久恒仪器技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 系列混合标准溶液的制备

按照表1配制了直链淀粉、支链淀粉标液和0.09 mol/L NaOH水溶液的混合标液，混匀待用。

表1 混合标准液

1.2.2 样品制备及方法处理

将待测稻谷样从田间收获后在实验室放置1周，平衡水分。每个稻谷样随机取适量，用JLGIII型砻谷机脱粒后，取10 g左右比较饱满的稻米粒，用JNM-III型碾米机碾磨成精米，置于密封袋中保存备用。

（1）国标法：参照GB/T 15683—2008《大米直链淀粉含量的测定》的方法测定，对上述制备的样品进行脱脂处理后旋风磨粉碎成细粉过80目筛。称取0.100 0 g试样于100 mL锥形瓶中，加入1 mL乙醇溶液和9 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，在沸水浴中加热10 min，冷却转移至100 mL容量瓶定容。准确移取5.0 mL分散液，1.0 mL 1.0 mol/L HAc溶液，2.0 mL碘试剂（2.000 g碘化钾、0.200 g碘，加水定容至100 mL，现配现用）置100 mL容量瓶，加水至刻度。用空白溶液调零，利用分光光度计在720 nm处测定吸光度。

（2）单粒米快速法：在每个样品中随机取整精米作直链淀粉含量测定。用研钵将单粒精米研磨成粉，称量0.010 0 g米粉置于10 mL试管中，加入0.1 mL 95%乙醇溶液和0.9 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，轻轻摇匀，使其分散。然后，将其放入100 ℃恒温干燥箱中加热10 min后拿出，冷至室温。各准确移取1.25 mL试样分散液、混合标准溶液和0.09 mol/L NaOH水溶液（作空白对照），置预先加入10 mL左右水的25 mL比色管中，加入0.25 mL HAc溶液，摇匀，加入0.5 mL碘试剂，加水定容至刻度，摇匀，静置10～15 min。使用移液枪各准确移取250 μL待测样、标准样以及空白样至96孔塑料微孔板中，使用ELX-800酶标仪（微孔分光光度计）于630、490 nm处，测量其吸光度。以双波段的吸光度之差为纵坐标，以直链淀粉含量为横坐标描绘标准曲线。然后通过回归方程计算各个待测样的直链淀粉含量。

1.2.3 稻米垩白度的测定

从每个品种中各随机挑选出含垩白的米粒10粒作为待测米粒，通过大米外观品质检测仪扫描得到稻米图像。经过人工确认后，仪器自动分析处理图像计算得到垩白度。

2 结果与分析

2.1 2种方法处理过程的差异分析

单粒米快速法和国标法处理过程中差异性主要表现在使用的仪器设备、试剂的消耗量、测定的用时量等方面。单粒米快速法摒弃了国标法中100 mL容量瓶定容和沸水浴加热操作，采用了10 mL试管，放置于试管架中并使用恒温干燥箱加热。摒弃了国标法中使用紫外可见分光光度计单个依次测定吸光度的操作，采用酶标仪双波长法同时测定96个样品的吸光度。两者相较，单粒米快速法操作简便、试剂消耗量少、测定用时短。

2.2 直链淀粉测定波长和参比波长的选择

以碘试剂为空白，分别对1 mg/mL直链淀粉、1 mg/mL支链淀粉标准溶液按1.2.2（2）的方法处理所得的直链淀粉-碘复合物、支链淀粉-碘复合物扫描液通过UV-2600紫外可见分光光度计，在400～900 nm区域进行光谱扫描。如图1所示，直链淀粉、支链淀粉的最大吸收波长分别为630 nm和540 nm，根据等吸收点作图法确定直链淀粉的测定波长为630 nm，参比波长为490 nm；支链淀粉的测定波长为540 nm和参比波长为720 nm。

图1 直链淀粉与支链淀粉的扫描图谱

2.3 2种方法标准曲线的建立

将按1.2.1方法所配制的直链淀粉含量的0%～35%的标准混合液，先后使用本实验的单粒米快速法和国标法测定其吸光度。单粒米快速法采用双波长法，利用ELX-800酶标仪同时测得630、490 nm处的吸光度，以△A（A630nm-A490nm）为纵坐标，直链淀粉含量（%）为横坐标，建立标准曲线，如图2（a）所示，其线性相关系数R2为0.998 7。如图2（b）所示，国标法的线性相关系数R2为0.999 1，说明2种方法所测量的吸光度均与直链淀粉含量之间有较好的线性关联。

图2 2种方法的标准曲线

2.4 2种测定方法结果描述性分析

用单粒米快速法和国标法分别测定了10个稻米样品的直链淀粉含量，每个样品设置10个平行，取其均值作为结果值。如表2所示，单粒米快速法所测得的直链淀粉含量均略高于国标法，但所呈现出的趋势保持一致且差值均小于2%，结果几无差异。通过t检验分析得到P值>0.05，说明2种方法之间也并无显著的差异。同时由表2可知，单粒米快速法测定的直链淀粉含量变异系数在1.87% ～ 5.69%，国标法的变异系数在1.76% ～ 5.07%，两者之间相差无几且稳定性都较好。综上所述，单粒米快速法能较精确地测定稻米中直链淀粉含量，同时满足对大批量样品的快速测定和筛选要求。

表2 2种方法测得的直链淀粉含量

2.5 单粒米快速法不同稻米粒直链淀粉含量差异性分析

每个稻米样品分别取10粒正常粒和10粒高垩白粒（垩白度>50%），样品编号10粳糯稻样不做该实验。用单粒米快速法测定其直链淀粉含量，取其均值为结果值。如图3所示，早籼稻的直链淀粉含量明显高于粳稻和晚籼稻，粳稻略低于晚籼稻。同时，根据图3可知，粳稻与晚籼稻的直链淀粉含量和垩白度之间基本无关联，早籼稻高垩白粒的直链淀粉含量与正常粒和结果值之间有较大的差别，说明对早籼稻来说直链淀粉含量和垩白度之间具有一定的关联。

图3 单粒米快速法不同稻米粒直链淀粉含量比较

3 讨论与结论

本文中的单粒米快速法由国标法改进而来，采用了10 mL试管，可放入试管架中并置于恒温干燥箱中加热，在能保证充分糊化的前提下便于批量操作，并利用酶标仪（96孔微孔板分光光度计）对直链淀粉含量进行批量测定，具备简便易操作、试剂用量少、可批量检测等优势，同时采用双波长法，不仅消除了直链、支链淀粉吸收背景的相互影响，也消除了96孔塑料微孔板每个孔之间的吸光度差异，能大幅提高结果的准确性。试验表明，该方法测定的直链淀粉含量相关系数为0.998 7，变异系数范围为1.87% ～ 5.69%，具有良好的相关性和稳定性，可满足选种选育中的大规模筛选。此外，一般酶标仪都自配630、490 nm滤光片，减少了相应检测成本。如有需要可额外自配540、720 nm滤光片，可同时测得稻米中直链淀粉、支链淀粉以及总淀粉含量。

为促进稻米优良新品种的选育，林赵淼等[11-12]，对影响稻米食味品质的相关基因做了比较深入的研究，直链淀粉含量受到三倍体基因型的控制，同时又受到一些相关品质特性（垩白度、胶稠度、透明度等）影响。本文通过单粒米快速法对不同品种类型、同种不同垩白度的稻米进行了初步的研究，旨在为遗传选育工作提供一些参考性依据。试验表明：在各个品种中，早籼稻品种的直链淀粉含量明显高于粳稻和晚籼稻品种，且与垩白度之间存在一定的相关性，高垩白早籼稻的直链淀粉含量普遍高于正常早籼稻。粳稻品种的直链淀粉含量略低于晚籼稻品种，且这两个品种的直链淀粉含量与垩白度之间几乎无相关性。