欧李组培快繁培养基的筛选

袁振，廖荣君，乔福利，冯丽花，辛欣，冯殿齐*

(1.山东一滕新材料股份有限公司，山东泰安 271000；2.山东益得来生物科技有限公司，山东泰安 271000；3.山东泰山源农业科技有限公司，山东泰安 271000；4.泰安市园林绿化管理服务中心，山东泰安 271000；5.泰山风景名胜区管理委员会，山东泰安 271000)

欧李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.)为蔷薇科樱桃属灌木植物，在中国北方14个省(市、区)有原始分布。其果实营养价值高，钙、硒、原花青素等的含量远高于苹果等水果[1]，果仁是中药材郁李仁。欧李是生态建设的优良树种[2]。发展欧李产业具有重要的生态、民生、健康意义。山东一滕新材料股份有限公司对4个欧李优系进行了组培试验，研究不同组培阶段的适宜培养基，为欧李组培快繁技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的外植体材料包括4个欧李优系，编号TSO-4、TSO-5、TSO-7、TSO-11，其中TSO-4、TSO-5、TSO-7由山东一滕集团从山西农业大学引进，TSO-11从野生欧李种子育苗选出。分别在各优系的嫁接苗上选取生长健壮、无病虫害的当年生枝条采样，采样时连续3天以上为晴天。

植物生长调节剂：细胞分裂素为99% 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，上海金穗生物科技有限公司；类生长素98% 1-萘乙酸(NAA),国药集团化学试剂有限公司；生长素99%吲哚乙酸(IAA)，润友化学有限公司。

组培前期(至增殖培养)于2018年3月至2019年9月在泰安市天泽农园组培实验室及二代育苗温室进行；自生根及后续培养转入泰山区花样年华植物钙研究院组培中心进行。组培中心温度25±3 ℃、光照强度3 000～6 000 Lx，光照时间每天12 h，相对湿度40～80%，不定期用75%酒精喷雾杀菌降尘，每天晚上开紫外线灯消毒1 h。

1.2 试验方法

外植体预处理与消毒。取欧李嫩枝的顶芽及带叶腋的茎段作为外植体，剪去叶片，剪成3～4 cm的带芽茎段，洗去灰尘，流水冲洗30 min，装入玻璃瓶备用。外植体先用75%的酒精进行常规消毒30 s，再用0.1%的升汞消毒，升汞消毒设9个时段：3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5min，消毒完毕用无菌水冲洗3次，研究外植体接种后的成活率及生长情况，筛选适宜的升汞消毒时间。

初代培养。初代培养诱导外植体产生丛生芽。用MS作为基础培养基，加入0.1 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、7 g/L琼脂粉，pH值调至5.8～6.2。加入6-BA的浓度，TSO-4设6个，为0.3、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/L；TSO-5、TSO-7、TSO-11均设3个，0.5、1.0、2.0 mg/L。培养基分装于容量300 mL的玻璃瓶中，每瓶40～50 mL，高温灭菌20 min，冷凝待用。超净台用75%的酒精消毒，将灭好菌的培养基、无菌水等放进超净台，紫外灯灭菌30 min，吹风20 min。将已消毒的外植体取出，切成1～2 cm的小段，同一激素处理的外植体接种5瓶。培养周期30 d。把已污染的外植体及时清理出培养室。研究各处理的平均出芽率和芽质量，筛选出合适的初代培养基。

继代培养。继代培养用MS做继代基础培养基，加入0.1 mg/L NAA，蔗糖30 g/L、琼脂粉7 g/L。4个欧李优系均设5个浓度的6-BA处理：0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，调节pH值至5.8～6.2，将初代培养从外植体上生出的丛生芽接入继代培养基中，相同激素浓度处理的丛生芽接种20瓶。培养周期30 d，研究丛生芽的平均增殖芽数和瓶苗生长状况，筛选出适宜的继代培养基。

生根培养。设置生根培养基6种。以1/2MS为生根基本培养基，加入蔗糖20 g/L，琼脂粉7 g/L，pH调至5.8～6.2。添加生长素3个浓度NAA，(0.05、0.1、0.2 mg/L)形成3种生根培养基。在此基础上再分别添加0.4 g/L的活性炭,又形成3种新的生根培养基，共6种生根培养基，即对欧李组培苗进行6个处理：处理1，1/2MS+ 0.05 mg/L NAA；处理2，1/2MS+ 0.1 mg/L NAA；处理3，1/2MS+ 0.2 mg/L NAA；处理4，1/2MS+ 0.05 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭；处理5，1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭；处理6，1/2MS+ 0.2 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭。将4个欧李优系生长健壮的无根组培苗切除基部的愈伤组织，分别接种于6种生根培养基上，即进行6个处理，每一处理20瓶，每瓶4株。生根培养周期30 d,调查生根率。

驯化、移栽、炼苗。驯化，当生根的欧李组培瓶苗根长2 cm左右时，置于炼苗温室内，自然光下封口驯化10 d，敞口驯化1 d，之后进行移栽。移栽、炼苗，将无菌苗取出瓶,洗净根部的培养基，移栽于育苗盘。在温室大棚内搭建小拱棚，在离地2.5 m处设置遮阳网，保持拱棚中温度20～30 ℃，湿度40～80%进行炼苗。30 d后移栽到相同基质的塑料营养钵中。设5种炼苗基质分别为沙、干苔藓、草炭土、草炭土∶珍珠岩=1∶1、草炭土∶珍珠岩=1∶2，调查炼苗效果，统计成活苗数，计算移栽成活率，观察苗的生长状况。

日常护理。根据气温和湿度揭盖拱棚的薄膜进行通风换气。根据大棚空气湿度和土壤湿度进行水分管理。根据幼苗的生长状况进行施肥管理。对幼苗每周喷施1次植物营养液。对病虫害以防为主，喷施杀菌剂托布津或杀虫药。

1.3 数据处理

成活率、增殖系数、生根率等指标，用Excel 2007软件进行统计分析。

成活率(%)=成活芽数/接种芽数×100。

增殖系数=∑形成芽数/接种芽数。

生根率(%)=生根苗数/接种数×100。

2 结果与分析

2.1 升汞消毒时间对欧李外植体成活率的影响

由表1可见，不同的升汞消毒时间对外植体成活率影响很大。对于优系TSO-4外植体茎段，升汞消毒5 min的成活率最高(95.2%)，消毒7.5 min的成活率最低(18%)。对于优系TSO-5外植体茎段，消毒4.5 min的成活率最高(91.1%)，消毒 7.5min的成活率最低(12.4%)。对于优系TSO-7外植体茎段，消毒4 min的成活率最高(85.3%)，消毒7.5 min的成活率最低(10.2%)。对于优系TSO-11外植体茎段，消毒4 min的成活率最高(94.8%)，消毒7.5 min的成活率最低(13.3%)。

表1 升汞消毒时间对欧李外植体成活率的影响

2.2 不同浓度的6-BA对初代培养诱导芽的效果

如表2，不同培养基对欧李茎段不定芽的诱导效果不同。TSO-4茎段，当NAA浓度0.1 mg/L 不变，6-BA浓度为0.3～2.0 mg/L变化时，均有不定芽产生。6-BA浓度在0.5～1.5 mg/L变化时欧李的分化率均达90%以上。出芽质量以6-BA浓度0.5 mg/L最好。TSO-5、TSO-7和TSO-11茎段在6-BA浓度为0.5～2.0 mg/L时，均有不定芽产生，分化率均达78%以上。出芽质量以6-BA浓度0.5 mg/L最好。因此，以芽分化率和出芽质量做评价标准，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L为4个欧李优系茎段诱导发芽的最适培养基。

表2 不同6-BA浓度的初代培养基中4个欧李优系不定芽的诱导情况

2.3 不同浓度生长素和细胞分裂素对继代培养增殖苗的效果

如表3，细胞分裂素6-BA浓度0.3 mg/L保持不变时，生长素NAA浓度在0.05～0.2 mg/L之间变动，4个欧李优系组培苗生长均正常，以NAA浓度为0.1 mg/L时生长状况最好。

表3 不同NAA浓度对4个优系欧李组培苗苗质的作用效果 mg/L

如表4，4个欧李优系组培苗在0.1 mg/L生长素NAA下，培养30 d时，组培苗的增殖系数随细胞分裂素6-BA浓度的升高呈先升后降变化，1.5 mg/L 6-BA时，平均增殖系数最多，TSO-4为9.48、TSO-5为9.54、TSO-7为8.01、TSO-11为7.64。其生长情况是，6-BA 1.0 mg/L时，继代苗严重玻璃化，难以继续利用。适合4个欧李优系组培增殖生长的最适培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。6-BA 0.3mg/L时，增殖系数最小。

表4 不同浓度的细胞分裂素对4个欧李优系继代增殖的效果

2.4 不同生根培养基的生根效果

如图1，优系TSO-4苗加活性炭(处理4、5、6)的生根率高于不加活性炭(处理1、2、3)的。处理5的生根率最高。即优系TSO-4最适生根培养基配方是1/2MS+0.1 mg/L NAA + 0.4 g/L活性炭；优系TSO-5苗加活性炭(处理4、5、6)的生根率低于不添加活性炭(处理1、2、3)的。处理1的生根率最高。即TSO-5最适生根培养基是1/2MS+0.05 mg/L NAA；TSO-7苗加活性炭(处理4、5)的生根率低于不加活性炭(处理1、2)的，但加活性炭(处理6)的生根率高于不加活性炭(处理3)的。处理1的生根率最高。即在6种培养基中，TSO-7最适生根培养基是1/2MS+0.05 mg/L NAA；TSO-11苗加活性炭(处理4、5、6)的生根率低于不加活性炭(处理1、2、3)的。处理2的生根率最高。即TSO-11最适生根培养基是1/2MS+ 0.1 mg/L NAA。

图1 不同培养基对欧李茎段生根率的影响

如表5，因优系TSO-7的生根较难，采用MS培养基不同浓度(1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS)，生长素吲哚乙酸(IAA)浓度0.05 mg/L时，结果是1/8MS培养基的生根率高(66.7%)，生长状况良好。TSO-7的最适生根培养基是1/8MS+0.05 mg/LIAA。

表5 TSO-7不同盐浓度培养基对生根的影响

如表6，欧李TSO-4苗炼苗移栽时发现，不同基质对组培苗移栽的成活率不同。混合基质的成活率比单一基质的好，当基质配比为草炭土∶珍珠岩=1∶2时，成活率高达85%。

表6 欧李TSO-4号组培苗不同基质移栽的成活率

4 小结与讨论

以欧李带叶腋的茎段进行组培快繁中，用清水洗去外植体表面的灰尘及污垢，在流水下冲洗30 min，75%的酒精消毒30 s，最后用0.1%升汞消毒至较好的时段为：TSO-4苗处理5 min，TSO-5苗处理4.5 min，TSO-7苗处理4 min，TSO-11苗处理4 min时，成活率分别最高。进行腋芽诱导时，4个优系欧李均在培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA中可获得较高的增殖系数，且苗的长势优。这与刘琳等[3]的研究结果符合。欧李生根的培养基为：TSO-4苗是1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭，TSO-5苗是1/2 MS+0.05 mg/L NAA，TSO-7苗是1/8MS+ 0.05 mg/L IAA，TSO-11是1/2MS+0.1 mg/L NAA。欧李TSO-4移栽炼苗时，以草炭土∶珍珠岩=1∶2为优，成活率85%。

外植体用酒精灯烤瓶口可以显著降低组培苗的污染率。消毒过程中，无菌水的用量不足，污染率增加。欧李有些茎段诱导出来的芽玻璃化严重的问题，可能是激素过多造成水分代谢失衡造成。这与梁伟玲等[4]的研究结果相近。玻璃化现象与培养基中6-BA的添加量有关。6-BA浓度降低，玻璃化现象变轻，叶子普遍变大，无再出现茎干畸形。畸形苗与培养基里细胞分裂素浓度较高有关。

增殖培养中出现的单芽接入叶片发黄，长势不佳，几个芽凑成一簇接入可以避免叶片发黄，可选取芽丛进行增殖，可在短时间内获得大批量丛生芽。生根培养时：培养基中无机盐的浓度显著影响生根效果，1/8MS>1/4MS>1/2MS。张秀丽等[1]研究表明，生根最佳配方是1/2MS+0.05 mg/L IBA。本研究预试验中发现，IBA对欧李TSO-4、TSO-5、TSO-7的生根效果均不理想。这可能与欧李的基因型有关系。生根过程中也出现了一定量的茎尖坏死，叶黄，枯萎等现象。生根试验中还发现，长得较高的继代苗，把上半部分剪掉用于继代，下半部分接入生根培养基能够正常生根，但不能长出新的茎芽，叶片最后枯萎掉落。这可能是下半段组培苗本身存有一定量的营养，可以用于生根，生根消耗掉营养后，再无足够的营养长出嫩芽。

瓶苗的炼苗移栽在选择基质种类、搭配水分、湿度、温度、光照等方面需严格控制，才能提高移苗成活率。小苗木质化程度低，易倒伏，易感染病菌，移栽后要加强管理，重视保温、保湿、补水，必要时喷洒一定量的灭菌剂，拔除杂草，强光时覆盖遮阳网，保持良好的生态环境。瓶苗移栽时不能直接从瓶内取出，而是要将瓶带苗一起拿出组培室，以逐渐适应外界环境。炼苗要综合考虑炼苗基质的保水，保肥，通透性强的要求，合理搭配基质，以草炭土∶珍珠岩=1∶1时，移苗成活率不高，可能是珍珠岩少，通透性差，苗易萎蔫。在给刚移栽的小苗喷水时，整个小环境也喷洒水分，提高成活率。