复合菌和鸡粪生物炭对镍和镉污染土壤的修复效果研究

2022-09-02杨昳陈元晖张春燕张羽李明堂

农业环境科学学报 2022年8期

杨昳，陈元晖，张春燕，张羽，李明堂

（吉林农业大学资源与环境学院，长春 130118）

重金属污染土壤的治理修复一直是农业环境领域研究的难点和重点，在碳达峰和碳中和背景下，研发低碳绿色修复技术对解决目前重金属污染土壤治理修复中存在的问题，保障农田生态系统安全和粮食安全具有重要的现实意义。环境中存在着一类可通过自身的生产代谢过程诱导形成重金属碳酸盐沉淀的微生物，利用此类微生物能促进重金属形态的转化，对土壤中的重金属起到固定作用，并且可参与重金属污染土壤的微生态调控，因此近几年在重金属污染土壤修复方面越来越受到人们的重视，但此类微生物在土壤中往往缺乏竞争力，且对重金属的固定效果易受到土壤酸化的影响，因此提高微生物在土壤中的生存竞争力、增强微生物的修复效果已成为在实际应用中需要迫切解决的问题。生物炭具有比表面积较大、孔隙结构和官能团丰富、吸附性较强等特点，不仅能够吸附固定土壤中的重金属，对土壤酸化起到缓冲作用，而且能够为微生物的生长提供载体环境，已有部分研究证明了利用微生物和生物炭共同作用对重金属污染土壤的联合修复效果优于单一修复。目前，针对重金属碳酸盐矿化菌和生物炭对重金属污染土壤进行联合修复的研究相对较少，并且往往忽视了菌株的其他功能，植物促生菌可以通过产生吲哚乙酸和铁载体等物质促进植物生长，增强植物对重金属的抗性，降低植物对重金属的吸收，利用微生物既能固定土壤中的重金属又能促进植物生长增强其抗性，研究其与生物炭对重金属污染土壤的联合修复效果，对重金属污染土壤的修复治理具有重要意义。

吉林省磐石红旗岭矿区已经有约60 年的开采历史，周边耕地土壤重金属逐渐累积危及人体健康，成为亟待解决的土壤环境问题之一。研究表明该区域耕地土壤镍（Ni）和镉（Cd）的平均含量已达到吉林省土壤背景值的4.4 倍和1.3 倍，局部污染区域土壤Ni和Cd的超标率高达50%以上，玉米籽粒中Ni和Cd的超标率也在50%以上。目前，微生物和生物炭单一技术对重金属污染土壤虽然具有较好的修复潜力，但在实际应用中存在诸多障碍，与单一技术相比，微生物-生物炭联合修复技术不仅能够克服单一修复稳定性差、功能单一、持久性低的缺点，而且具有功能互补和协同增效的优点。因此，本研究通过利用吉林省矿区污染土壤进行玉米盆栽试验，研究了同时具有重金属碳酸盐矿化和植物促生功能的复合菌和生物炭在单一和联合作用下对Ni 和Cd 污染土壤的修复效果，以期为利用具有多种功能的复合微生物和生物炭高效修复Ni 和Cd 污染土壤提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自吉林省磐石红旗岭镍矿区周围的耕地土壤，自然风干过2 mm筛后用于玉米盆栽试验。供试土壤pH 为5.4，有机质含量为2.5%，碱解氮含量为39.4 mg·kg，有效磷含量为15.3 mg·kg，速效钾含量为159.0 mg·kg，土壤Ni的总量和有效态含量分别为292.5、42.1 mg·kg，土壤Cd 的总量和有效态含量分别为10.3、0.8 mg·kg。

供试玉米（L.）为金苑玉z658（z658），品种审定编号为辽审玉20180155，品种来源CY04×TY04。

供试菌株为本实验室从Ni 和Cd 复合污染的土壤中分离筛选出对Ni 和Cd 均具有较高抗性的沙福芽孢杆菌N4 和睾丸酮丛毛单胞菌ZG2。菌株N4 为沙福芽孢杆菌，Genbank 登录号为NR 041794.1，菌株ZG2 为睾丸酮丛毛单胞菌，Genbank 登录号为NR 116138.1。菌株N4产吲哚乙酸能力强，并能协同生物炭降低小白菜对Ni 和Cd 的吸收。菌株ZG2 产脲酶、吲哚乙酸和铁载体，并可诱导形成重金属碳酸盐沉淀来固定土壤中的Ni和Cd。

复合菌剂的制备：将菌株N4 和ZG2 在28 ℃和160 r·min振荡培养24 h 的条件下利用牛肉膏蛋白胨培养基进行活化和富集培养，将富集培养液按2%的比例接种到新鲜的牛肉膏蛋白胨培养基中在相同条件下培养，将培养后的发酵液在4 ℃和8 000 r·min条件下离心5 min，弃去上清液，用无菌水冲洗菌体细胞2次，然后将其再悬浮于无菌水中，得到OD为0.3左右的单一菌株菌悬液，按照1∶1 的比例混合，即为用于土壤修复的复合菌剂。

参照已报道的研究方法，将鸡粪在缺氧和600 ℃条件下热解得到的产物为供试生物炭，供试生物炭的元素组成为C：39.3%、H：1.1%、O：35.4%、N：1.8%；pH 为12.8、EC 为10.9 mS·cm、灰分为21.6%。生物炭过200 目筛后，将剩余未过筛的生物炭放入研钵中研磨，如此重复直至全部过200 目筛后得到供试微米生物炭。供试生物炭的粒径范围为50.0～300.0 μm，中位粒径D50为250.0 μm；供试微米生物炭的粒径范围为1.6～55.8 μm，中位粒径为18.0 μm，显著低于供试生物炭，处于微米级。生物炭的粒径分布特征如表1所示。

表1 生物炭的粒径分布特征Table 1 Particle size distribution characteristics of the biochar

1.2 土壤修复试验

向土壤样品中添加0.2%的尿素，并混合均匀，用于土壤修复试验。设置以下处理：无任何添加的对照处理（CK）、只添加复合菌剂（T1）、只添加生物炭（T2）、只添加微米生物炭（T3）、添加复合菌剂和生物炭（T4）、添加复合菌剂和微米生物炭（T5）。每种处理用土1 500 g，设置3组平行。生物炭和复合菌剂的添加方式：按照3%的比例将生物炭和微米生物炭分别加入到土壤中，混合均匀，一部分装入塑料盆（规格为上口直径16 cm、下口直径11 cm、高13 cm）作为T2和T3处理；将剩余部分先分别取少量平铺于盆底，喷洒复合菌剂湿润，再平铺一层，再喷洒复合菌剂，如此重复，直至150 mL 复合菌剂均匀喷洒于1 500 g 土样中，分别作为T4和T5处理；用同样的方式向未添加生物炭的土样中喷洒复合菌剂，作为T1处理。向未添加生物炭的土样中喷洒150 mL 无菌水作为CK 处理。将上述处理后的土壤样品中加入适量的蒸馏水进行湿润，然后移入人工气候箱，在光照强度为2 000 lx，温度为25 ℃，湿度60%，光暗比1∶1 条件下稳定修复一周，2 d喷水一次以维持土壤湿度。

1.3 玉米盆栽试验

挑选颗粒饱满无破损的玉米种子，以2%的NaClO溶液浸泡10 min 后用蒸馏水冲洗干净，在28 ℃下用蒸馏水浸种6 h，均匀摆放于铺有湿润纱布的育苗盘中避光催芽，出芽后恢复光照并挑选长势一致的玉米幼苗均匀移栽于修复后的土壤中，每盆2 株。移栽完成后，向T1、T4、T5 处理幼苗根际土壤施加10 mL 复合菌悬液。向每盆补充水分至水从盆底孔隙中微微渗出，移入人工气候箱（光照强度2 000 lx，温度25 ℃，湿度60%，光暗比1∶1）进行培养，每5 d 浇水一次保证玉米幼苗的正常生长，培养30 d后将玉米幼苗取出，收集与幼苗根部紧密结合的土壤即为根际土壤样品，然后用去离子水将幼苗根部洗净吸干水分，分离根部与地上部，置于105 ℃烘箱杀青30 min，调为60 ℃烘干至恒质量，粉碎后备测。

1.4 测定方法

用CEM MARS6 微波消解仪对土壤和植物样品进行消解，采用Tessier 五步法对土壤中Ni 和Cd 的化学形态进行提取，采用DTPA 浸提法提取土壤中Ni和Cd 的有效态，参考闫雷等的方法对叶片Ni 和Cd的亚细胞分布及化学形态进行分离和提取，采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS 7900）对上述过程获得的溶液进行Ni和Cd含量的测定。

叶片SPAD 值采用SPAD-502Plus 手持叶绿素仪测定，超氧化物歧化酶（SOD）活力采用总超氧化物歧化酶试剂盒（T-SOD）测定，丙二醛（MDA）含量采用丙二醛测试盒测定。

玉米根系逐层剪开，分批放入玻璃皿内并用镊子展开分枝，用EPSON V800 高分辨率扫描仪扫描根部图像，再用WinRHIZO 根系分析系统对扫描得到的全部图像进行分析，最后将每张图像对应的全部数据相加，即为测得的根系形态数据。

土壤微生物多样性检测由北京奥维森基因科技有限公司完成。细菌选取16S rDNA 区域扩增，真菌选取ITS1 区域扩增，利用Illumina Miseq 高通量测序平台测序。

1.5 数据分析

不同处理数据的差异性分析采用SPSS 23中单因素ANOVA检验，使用＜0.05确定数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同修复处理对根际土壤Ni和Cd 形态分布和有效态含量的影响

根际土壤中Ni 和Cd 的形态分布如图1a 和1b 所示。从图中可以看出，各处理均降低了根际土壤中可交换态Ni和Cd 的比例，使可交换态Ni向碳酸盐结合态及铁锰氧化物结合态转化，使可交换态Cd 向碳酸盐结合态及残渣态转化，并且联合修复的效果大于单一修复。与CK 相比，T5 处理使碳酸盐结合态Ni 和Cd 的含量分别升高了59.9%和68.4%，碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态Ni 的占比分别提高了67.9%和34.5%，碳酸盐结合态和残渣态Cd的占比分别提高了88.3%和14.9%。根际土壤Ni 和Cd 的有效态含量如图1c 和1d 所示，与CK 相比，各处理均不同程度降低了根际土壤Ni 和Cd 的有效态含量，联合处理的效果优于单一处理，其中T5处理使Ni和Cd有效态含量分别降低了66.5%和53.8%。

图1 修复对根际土壤Ni和Cd形态分布和有效态含量的影响Figure 1 Effects of remediation on the fraction distribution and available contents of Ni and Cd in rhizosphere soil

2.2 不同修复处理对玉米幼苗生长发育和抗氧化能力的影响

从表2 可以看出，复合菌和生物炭修复对盆栽玉米幼苗产生了多方面的促进作用，玉米幼苗的主根长、株高、生物量、叶绿素值SPAD 均不同程度地增大，幼苗叶片的SOD 活力增强，MDA 的累积量降低。总体作用顺序为T5＞T4＞T3＞T2＞T1。与CK 相比，T5处理使玉米幼苗的株高、主根长、生物量、叶绿素值SPAD 分别增加了103.6%、159.6%、550.9%、77.1%，幼苗叶片的SOD 活力增强了35.0%，MDA 含量降低了90.1%。

表2 修复对玉米幼苗生长发育和抗氧化能力的影响Table 2 Effects of remediation on growth and antioxidant capacity of maize seedlings

2.3 不同修复处理对玉米幼苗根系形态的影响

从表3 可以看出，修复后的土壤环境显著促进了玉米幼苗的根系发育，使玉米根系各项形态指标均显著升高，促进了玉米幼苗根部伸长的同时显著增加了玉米幼苗须根的数量，有利于玉米幼苗形成更发达的次生根系，总体作用顺序为T5＞T4＞T3＞T2＞T1。与CK 相比，T5 处理使玉米总根长、根投影面积、根表面积、根直径与根体积分别增大了57.1、42.0、41.2、7.2、31.3倍。

表3 修复对玉米幼苗根系形态的影响Table 3 Effects of remediation on root morphology of maize seedlings

2.4 不同修复处理对玉米幼苗Ni和Cd含量的影响

如图2 所示，不同修复处理均降低了玉米根部和地上部对Ni 和Cd 的吸收，减少了玉米根部、地上部Ni和Cd的含量，总体修复效果顺序为T5＞T4＞T2＞T3＞T1。与CK相比，T5处理使玉米根部与地上部的Ni含量分别降低了49.3%、69.4%，Cd 含量分别降低了41.9%、53.0%。

图2 修复对玉米幼苗Ni和Cd含量的影响Figure 2 Effects of remediation on Ni and Cd contents in maize seedlings

2.5 不同修复处理对叶片Ni和Cd 亚细胞分布和形态分布的影响

从图3a 和3b 可以看出，复合菌和生物炭单一及联合修复均增加了叶片细胞壁和可溶性部分结合Ni和Cd 的比例，减少了细胞器中Ni 和Cd 的比例，从而减轻了叶片细胞受到的毒害，提高了幼苗的抗性；从图3c 和3d 可以看出，复合菌和生物炭修复降低了叶片中两种迁移活性强的高毒性形态Ni 和Cd（F、F）的分布比例之和，增加了其他四种活性较弱的低毒性形态Ni 和Cd（F、F、F、F）的分布比例之和，因此减弱了Ni 和Cd 在叶片中的迁移活性，从而降低其毒性。与CK 相比，T5 处理使细胞器组分中Ni 和Cd的分布比例分别下降了25.6%和22.9%；使F、F两种形态的Ni 和Cd 的分布比例之和分别降低了40.2%、42.8%，F、F、F、F四种形态的Ni 和Cd分布比例之和分别增加了27.9%、19.2%，修复效果最显著。

图3 修复对叶片Ni和Cd亚细胞和形态分布的影响Figure 3 Effects of remediation on sub cellular and fractional distribution of Ni and Cd in leaves

2.6 不同修复处理对根际土壤微生物群落结构的影响

2.6.1 根际土壤微生物OTU分布

从图4 可以看出，与CK 相比，修复后根际土壤的细菌OTU 总数增多了70.6%～97.0%，真菌OTU 总数增多了176.2%～285.0%。各处理与CK 共有的细菌OTU 数目为1 289个，真菌OTU 数目为133个，特有细菌的OTU 数目增加了18.9%～70.8%，总体顺序为T3＞T5＞T1＞T2＞T4，特有真菌的OTU 数目增加了1.8～2.8倍，总体顺序为T5＞T1＞T2＞T4＞T3。

图4 修复对根际土壤细菌（a）和真菌（b）OTU分布的影响Figure 4 Effects of remediation on OTU distribution of bacteria（a）and fungi（b）in rhizosphere soil

2.6.2 根际土壤微生物群落Alpha多样性指数

从表4 可以看出，各处理改变了根际土壤的细菌群落Alpha 多样性指数。与CK 相比，各处理使Chao1、Shannon、Observed species 和PD whole tree 指数均明显升高，其中T5 处理的Chao1、Observed species和PD whole tree指数相对其他处理最高。

表4 修复对根际土壤细菌群落多样性的影响Table 4 Effects of remediation on bacterial community diversity in rhizosphere soil

从表5 可以看出，与CK 相比，不同处理使根际土壤的真菌群落Alpha 多样性指数均明显增长。其中，除Chao1 的T2 处理外，T5 处理的各项指数均高于其他处理。

表5 修复对根际土壤真菌群落多样性的影响Table 5 Effects of remediation on fungal community diversity in rhizosphere soil

2.6.3 不同修复处理对根际土壤微生物群落结构的影响

从图5a 可以看出，细菌群落结构中的优势门为变形菌（Proteobacteria）、拟杆菌（Bacteroidota）、髌骨菌（Patescibacteria）、单胞菌（Gemmatimonadota）、放线菌（Actinobacteriota）、酸杆菌（Acidobacteriota），相对丰度之和占各处理总序列量的85.7%～95.9%。与CK相比，复合菌和生物炭修复明显减少了变形菌（Proteobacteria）的相对丰度，增大了拟杆菌（Bacteroidota）的相对丰度，并且明显增加了根际土壤中后6 个相对丰度较小细菌门在总序列量中的比例。

从图5b 可以看出，各处理降低了根际土壤中未被识别的菌（unidentified）的占比，并且显著提高了子囊菌（Ascomycota）、担子菌（Basidiomycota）、壶菌（Chytridiomycota）、被孢霉（Mortierella）和球囊菌（Glomeromycota）等真菌门在根际土壤中的相对丰度，提高了根际土壤优势真菌门的丰富度和均匀度。

图5 门水平上根际土壤细菌（a）和真菌（b）的相对丰度Figure 5 The relative abundance of bacteria（a）and fungi（b）in rhizosphere soil at phylum level

2.6.4 根际土壤微生物群落相对丰度的变化和聚类分析

从图6a 可以看出，不同处理均使土壤中大多数优势细菌在属水平上的相对丰度均呈现升高的趋势，显著增加了土壤中优势细菌属的数量和种类，但也有少量细菌属在修复后相对丰度降低，如酸球菌（）、朱氏杆菌（）、微小寄生菌（）。

从图6b 可以看出，在属水平上不同处理的根际土壤真菌群落结构与CK相比均存在较大的差异。各处理土壤中共检测到20 个真菌属，CK 中检测到4 个相对丰度大于1%的真菌属，T1、T2、T3、T4、T5处理分别检测到16、14、10、15、17 个相对丰度大于1%的真菌属，土壤中优势真菌属的数量和种类显著增加，但多孢霉菌（）在修复后相对丰度降低。

图6 属水平上根际土壤细菌（a）和真菌（b）的相对丰度聚类热图Figure 6 The cluster heat map of relative abundance of bacteria（a）and fungi（b）in rhizosphere soil at genus level

3 讨论

土壤Ni 和Cd 污染会严重影响作物生长发育并进入食物链，危害人体健康。研究表明利用具有特定功能的微生物可对土壤重金属污染进行修复，MOHAMMADZADEH 等研究发现沙福芽孢杆菌促进了高浓度Ni 的土壤中向日葵根部、地上部的生长，显著缓解了Ni对植物生长的毒害作用。SHI等利用分离得到的丛毛单胞菌XL8减轻了Cd对水稻幼苗的影响。沙福芽孢杆菌N4和睾丸酮丛毛单胞菌ZG2的单一菌株已被证实能够产植物促生物质IAA、铁载体并能够诱导形成碳酸盐沉淀，降低小白菜对Ni 和Cd的吸收。本研究利用二者的复合菌修复Ni 和Cd污染土壤，发现利用复合菌可促进土壤中可交换态Ni和Cd向碳酸盐结合态转化，降低Ni和Cd的有效态含量，同时可促进玉米的生长发育，降低其对Ni和Cd的吸收，表明菌株N4和ZG2具有明显的联合修复作用。

近年来，生物炭在重金属污染修复方面得到了广泛应用，研究发现施用生物炭能降低Cd 对甜菜的毒性并降低其对Cd的吸收；张艺腾利用鸡粪生物炭固定了土壤中的Cu 和Zn，减少小白菜对Cu 和Zn的吸收；王雨琦等研究表明鸡粪生物炭促进了可交换态Ni 和Cd 向低毒害形态转化并促进了小白菜的生长。本研究发现鸡粪生物炭具有固定土壤中的Ni和Cd 的作用，降低Ni 和Cd 对玉米幼苗的毒害，进而促进其生长发育，降低玉米对Ni 和Cd 的吸收，表明鸡粪生物炭在Ni 和Cd 污染土壤修复方面具有重要的应用价值。

有研究表明芽孢杆菌与生物炭具有良好的协同效应，复合使用利于重金属污染土壤的修复；戚鑫等研究表明微生物与生物炭联合对Cd 的去除作用大于单一微生物。本研究发现，复合菌和生物炭联合修复时效果大于单一修复，能在更大程度上促进土壤中可交换态Ni 向碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态转化，可交换态Cd向碳酸盐结合态和残渣态转化，降低土壤中Ni 和Cd 有效态的含量；同时多方面促进了玉米幼苗生长，提升其抗氧化能力，显著增强了玉米次生根系的发育；降低了玉米对Ni 和Cd 的吸收；降低Ni和Cd在叶片细胞器的分布和叶片中迁移活性较强的高毒性形态Ni 和Cd 的比例。已有研究表明，通过调节重金属亚细胞水平上的选择性分布和重金属在植物体内的化学形态可以减弱重金属的毒害。此外，复合菌和微米生物炭联合修复的作用效果大于复合菌和生物炭联合，这可能是由于微米生物炭粒径较小，改善污染土壤理化性质的能力较强，有研究表明，与常规粒径的生物炭相比，颗粒较小的生物炭有利于改良土壤容重和田间持水量，对土壤物理性质有更强的积极影响，能够提升土壤质量，改善土壤结构；并且因其比表面积较大，表面吸附位点较多，吸附性能较强，增强了对重金属的钝化能力，进而限制了重金属在土壤中的迁移，改善酸化土壤的pH。

重金属污染会影响土壤中微生物的生长代谢反应，降低酶活性，抑制保护性基因的表达，可能造成土壤中微生物群落结构单一，致使土壤生态系统紊乱，减弱对外界环境胁迫的抵抗能力。有研究表明，在重金属钝化过程中，土壤微生物群落代谢得到增强，因此能提高土壤中有益菌的数量，促进土壤与微生物的协同稳定，本研究发现在门水平上，各处理增大了根际土壤中后六个相对丰度较小细菌门在总序列量中的比例，增加了常见优势真菌子囊菌、担子菌等真菌的相对丰度，子囊菌对重金属具有很强的耐受性，担子菌可以有效地转移重金属，其衍生物对土壤结构的稳定具有重要作用，这表明复合菌和生物炭通过对Ni 和Cd 的修复固定，能够显著降低Ni 和Cd污染对土壤微生物的毒害，提高了土壤微生物的生物量和多样性，促进了有益菌的生长繁殖。属水平上，各处理提高了土壤大多数优势细菌、真菌的丰度，但降低了细菌属中酸球菌、朱氏杆菌、微小寄生菌及真菌属中多孢霉菌的丰度。酸球菌是属于酸杆菌门的一类嗜酸菌，该类细菌丰度的降低可能与修复后土壤理化性质的改变有关；朱氏杆菌是被归类于变形菌门黄单胞菌科的一类植物病原菌，其减少说明修复抑制了植物致病菌生长；微小寄生菌是一种极小的需要寄生在宿主细菌表面进行生长和增殖的寄生细菌，同时对宿主细菌具有选择性，目前研究发现大多数微小寄生菌的宿主细菌为放线菌、酸杆菌，因此酸杆菌的丰度降低也可能是导致其丰度降低的原因。多孢霉菌是一类抑制寄生植物的出苗率的植物致病真菌，此类真菌减少也表明了复合菌和生物炭能够通过对Ni 和Cd 的修复固定促进了土壤中微生物菌群结构的改善，抑制了土壤中植物致病菌的存活，有助于植物抵抗病害。