砷对小麦苗期生长的影响及降低砷毒性的措施

2022-09-02马瑞王海芳卢静吕溥李金惠

农业环境科学学报 2022年8期

马瑞，王海芳，卢静*，吕溥，李金惠

（1.中北大学环境与安全工程学院，太原 030051；2.清华大学环境学院，北京 100084）

砷（As）是一种广泛分布于自然界的有毒类金属元素，据统计，我国每年因燃煤导致的砷化物的排放量高达1 500 t，As 的污染问题已相当严重。山西省是煤炭大省，煤炭、矿产开采过程中有大量As 释放进入环境，刘汉斌等发现大同市侏罗纪煤中As的含量是全国煤中As 均值的2 倍，史晓凯等的研究表明山西忻州市高As 硫铁矿开采中释放的As 随大气沉降、河水灌溉等方式进入土壤，使矿区周边农田土壤As 的污染问题愈发严重。As 不仅干扰作物的正常生长，还会通过土壤-农作物的迁移，进入食物链威胁人体健康。

目前，已有文献报道了As对粮食作物的危害，主要表现为抑制作物水分代谢、呼吸作用、光合作用及相关酶的活性等。一般而言，As 对作物的毒害程度与作物生长介质中As 的含量密切相关，当生长介质中As 的含量超过植物所能承受的临界值后，As 含量越高，对植物的毒害效应就越明显。土壤中As 对作物的毒害不仅与含量有关，更与其形态转变及生物有效性密切相关，尤其是无机As（Ⅲ）的生物有效性。已有学者比较了小麦、萝卜和玉米在受As 污染的褐土上的生长状况，发现受As 毒害程度最强的是小麦。目前，小麦已经成为人类患癌症的新型暴露途径，全球0.02%的人由于食用As污染的小麦而面临患癌症的风险。ZHAO 等的研究表明，小麦籽粒中的As以无机As形态存在，作物累积的As全部来自于土壤。CHEN 等发现在碱性环境下，土壤可提取态As 与小麦籽粒As 显著线性相关，揭示了土壤As向小麦籽粒的转运结果。此外，小麦茎秆通常被用于饲养牲畜或被还田，茎秆中累积的As 很可能通过食物链再次进入人体，对人体造成潜在危害。山西以面食著称，小麦是山西的主要粮食作物，该地耕作土壤普遍呈中碱性，因此研究As 对小麦生长的影响意义重大。

降低As 的生物有效性是减缓As 对作物毒害最主要的途径。土壤环境中的As 主要以无机As 形态[As（Ⅲ）、As（Ⅴ）]存在，其中As（Ⅲ）对作物的毒性远大于As（Ⅴ）。亚砷酸和硅酸的解离常数、分子结构大小接近，MA 等的研究表明硅酸转运水通道蛋白（OsNIP2;1，即Lsi1）是As（Ⅲ）进入水稻根系的一个重要途径，Lsi2 可调控根系As（Ⅲ）向木质部的流动；LIU 等添加Si 肥使水稻茎叶和稻谷中的As 分别降低了78%和16%；李剑睿等发现施Si肥会促使土壤形成重金属硅酸盐沉淀，降低土壤As 的迁移性和生物有效性。As（Ⅴ）与磷（P）为同族元素，砷酸盐与磷酸盐的化学性质相似，As（Ⅴ）可通过磷的吸收转运通道进入植物体内；WANG 等研究发现，增加培养液中磷酸盐的浓度能显著抑制蜈蚣草（）对As（Ⅴ）的吸收；PICKERING 等采取同位素标记的方法研究As（Ⅴ）的吸收动力学特征，结果表明P能抑制植物对As（Ⅴ）的吸收。

本研究以两种小麦作为供试材料，研究不同浓度As（Ⅲ）处理后两种小麦各组织部位对As（Ⅲ）吸收、转运和累积的差异，以及As（Ⅲ）对小麦的毒性效应，为准确了解As（Ⅲ）对小麦的毒性及小麦对As（Ⅲ）的耐性提供理论依据，同时提出减缓小麦受As 毒害的有效农艺措施。

1 材料与方法

1.1 供试材料

晋麦1号和晋麦2号均是山西省田间广泛种植的小麦品种，供试小麦种子购买于某种子公司。

1.2 供试土壤

供试土壤采自山西省太原市二龙山表层土壤（0～20 cm），土壤类型为棕壤。将采集后的土壤自然风干，过4 mm筛后备用。土壤的基本性质如表1所示。

表1 供试土壤的基本性质Table 1 Basic properties of the test soil

1.3 试验设计

1.3.1 幼苗的培育

分别选取两种饱满的小麦种子各约300 颗，先用10%的过氧化氢（HO）消毒，再用蒸馏水冲洗干净后置于铺有湿润滤纸的培养皿中，待种子的胚稍微萌动后放于4 ℃冰箱中春化7 d（无光照），取出后置于硬质网面（两端用泡沫固定）上，漂浮在盛有去离子水的盆钵中，曝气、光照（10 h·d）培养，当叶片长到5 cm时，用1/2 霍格兰营养液曝气培养，期间每3 d 换一次营养液，待幼苗长至三叶一心后备用。

1.3.2 水培试验

挑选1.3.1 中长势好的三叶一心小麦幼苗进行水培As（Ⅲ）处理试验。试验采用容积为300 mL的塑料盆钵，首先用NaAsO配制10 mmol·L的As（Ⅲ）母液，用移液枪分别吸取0.125、0.25、0.625、1.25 mL 和2.5 mL As（Ⅲ）母液至盛有200 mL 霍格兰全营养液（调节pH=6.0）的容量瓶中，再用该营养液定容至250 mL 后置于塑料盆钵中，配制成5、10、25、50、100 μmol·LAs（Ⅲ）处理溶液。As（Ⅲ）吸收试验[可用于As（Ⅲ）半抑制浓度的分析]为5 d，As（Ⅲ）吸收动力学试验为30 min，As（Ⅲ）氧化特征分析试验为3 d，各试验具体的浓度设置如表2所示，对照组为不加As（Ⅲ）的营养液，每个试验浓度设置3个重复，每个重复5棵幼苗，试验过程中每2 d 换一次处理溶液，均连接曝气装置，保证小麦根系的氧气供给。

表2 水培试验设计（μmol·L-1）Table 2 Design of the hydroponic experiments（μmol·L-1）

1.3.3 盆栽试验

将过筛的土壤置于塑料盆钵中，每盆1.5 kg，向每个盆钵中加入基肥（氮肥为尿素，100 mg·盆；钾肥、磷肥为KHPO，320 mg·盆），而后在各个盆钵中加入10 mg·kgAs（Ⅲ），试验设置：①对照组CK，即不添加P、Si 肥的As 处理组；②低浓度磷肥P1（329 mg·盆KHPO），即As+50 mg·kgP；③高浓度磷肥P2（658 mg·盆KHPO），即As+100 mg·kgP；④低浓度硅肥Si1（322 mg·盆SiO），即As+100 mg·kgSi；⑤高浓度硅肥Si2（644 mg·盆SiO），即As+200 mg·kgSi。上述处理均需搅拌均匀，每个处理设置3 个重复，每个重复3 棵幼苗。挑选1.3.1 中长势好的三叶一心晋麦2 号幼苗进行移栽，在小麦幼苗移栽前，先将加入As（Ⅲ）、P 肥和Si 肥的土壤加水湿透后培养两周，以使As 元素均匀分布在土壤固相表面和液相中。小麦移栽后，试验处理时间持续45 d，期间保持土壤水分为田间最大持水量的80%。

1.4 样品的测定及分析

1.4.1 样品生物量的测定

鲜质量：处理结束后，分离小麦幼苗的根系和茎叶，用去离子水冲洗干净，吸水纸将表面水分擦干后置于万分之一天平称量。干质量：将样品置于70 ℃烘箱，48～72 h质量恒定后称量。

1.4.2 样品As含量的测定

称取烘干磨细的样品（水培试验样品量＜0.25 g，称全部样品；样品量≥0.25 g，称0.25 g 样品）于消解管内，向其中加入5 mL 混酸（HNO∶HClO=87∶13，∶）进行消解，结束后用2%HNO定容，用电感耦合等离子体光谱仪（ICP-OES，Thermo Fisher iCAP 7000）测定As含量。

1.4.3 氧化特征分析

HO：采用比色法测定小麦各组织中HO的含量。

丙二醛（MDA）：采用5%三氯乙酸（100 mL 水中加入5 g 三氯乙酸）提取法测定小麦各组织中MDA含量。

1.5 数据处理

数据处理、相关性分析和图形绘制采用Sigma-Plot 13.0 软件，数据差异性统计采用SPSS 20.0 软件，采用单因素方差齐性Tukey 方式分析，图中的误差线均是标准误差（SE）。

2 结果与讨论

2.1 As（Ⅲ）处理对小麦苗期根系、茎叶生物量及相对根长的影响

两种小麦根系、茎叶生物量均随溶液As（Ⅲ）浓度的增加而降低（图1a 和图1b），经5 μmol·LAs（Ⅲ）处理后，晋麦1 号根系、茎叶生物量分别降低90%和60%，降低幅度均极显著高于晋麦2 号。两种小麦相对根长随As（Ⅲ）处理浓度的增加而减少（图1c），晋麦1 号根长减少13%～40%，晋麦2 号减少3%～35%。由此可知，晋麦1号根系、茎叶生长受As（Ⅲ）抑制的程度显著高于晋麦2 号，环境中As（Ⅲ）的存在，会对晋麦1 号产生较严重的毒害效应。该结果与AGNIHOTRI 等的研究结果一致，当小麦植株暴露在As环境中时，其吸收营养成分的能力降低，蛋白合成速度减弱，最终导致小麦植株生物量下降。

图1 不同浓度As（Ⅲ）处理后两种小麦根系生物量、茎叶生物量及相对根长的变化Figure 1 The change of root biomass and shoot biomass and relative root elongation of two wheat varieties under different As（Ⅲ）concentration treatments

2.2 As（Ⅲ）处理对小麦苗期根系、茎叶As含量的影响

两种小麦根系、茎叶As 含量均随As（Ⅲ）处理浓度的增加而增加（图2a 和图2b）。晋麦1 号根系、茎叶As含量总体上极显著低于晋麦2号，只在50 μmol·LAs（Ⅲ）处理时，晋麦1 号茎叶As 含量与晋麦2 号无显著差异，这可能是由于晋麦1号茎叶对As（Ⅲ）的吸收速率或根系向茎叶的转运能力在该浓度下有所加强，也可能与调控小麦As吸收的基因有关，具体机理需进一步研究。上述结果表明两种小麦对As（Ⅲ）的吸收、累积存在差异，晋麦2号对As（Ⅲ）的吸收、累积和耐受能力较高，该结果与国内外报道的小麦籽粒和茎秆对As的累积能力在不同品种间存在很大差异的结果一致。KUNDU 等在As 污染条件下种植4 种小麦，其中As 累积量最高品种的籽粒、茎叶中As含量是最低品种的1.2～2.7倍。

由图2c可知，两种小麦根系As含量与茎叶As含量显著线性相关，茎叶As含量随根系As含量的增加而增加，说明茎叶中As的累积主要来自于根系As向茎叶的转运，根系As累积得越多，向茎叶中转运的As就越多，茎叶部分As的累积量也相应增加。TONG等在内蒙古河套地区的研究也表明，向小麦灌溉As污染的地下水不仅会增加表土层As的含量，还会影响土壤中As的生物有效性，进而增加小麦茎秆、籽粒中As的含量。

图2 不同浓度As（Ⅲ）处理后小麦根系、茎叶As含量的变化及小麦根系As含量与茎叶As含量的相关关系Figure 2 The change of root As concentration and shoot As concentration of two wheat varieties and the correlation between root As concentration and shoot As concentration under different As（Ⅲ）concentration treatments

2.3 相关性分析

经As（Ⅲ）处理后，两种小麦根系生物量均随根系As 含量的增加迅速降低（图3a），说明根系As 的累积是导致根系生物量减少的重要原因。晋麦1 号根系As 含量与根长，茎叶As 含量与茎叶生物量均呈显著非线性关系（图3b 和图3c），说明晋麦1 号根长受抑制与根系As 含量的增加关系密切，茎叶生物量降低与茎叶As 含量的增加有关，具体的机理需要从分子生物学角度进一步研究；晋麦2 号根系As 含量与根长，茎叶As 含量与茎叶生物量均呈极显著线性关系，说明晋麦2 号根系As 的累积是导致根长受阻的主要原因，茎叶As 的累积直接导致茎叶生物量的减少。

图3 不同浓度As（Ⅲ）处理后小麦根系As含量与根系生物量、根长的相关关系及茎As含量与茎叶生物量的相关关系Figure 3 The correlation between root As concentration and root biomass and root length,and the correlation between shoot As concentration and shoot biomass under As（Ⅲ）treatments

有研究表明小麦暴露在As 环境中时，其根系分生组织的有丝分裂活性显著降低，细胞分裂速率、根系伸长和新细胞的生长受到抑制，本研究也发现在As 环境中，两种小麦根长受到不同程度抑制；此外，有研究显示暴露在As 环境中的小麦，其各组织部位生物量会降低，本研究也说明小麦根系As 的累积是造成根系生物量减少的主要原因，低浓度As（Ⅲ）处理后，根系生物量即迅速降低。两种小麦根系都具有较强的As 转运能力，茎叶中As 的累积主要是通过根系As向地上部分的转运而来。

As（Ⅲ）处理后，晋麦1 号根系、茎叶As 含量显著低于晋麦2号，且生物量也显著降低，说明晋麦1号是As（Ⅲ）相对敏感品种，受As（Ⅲ）影响的程度较大，更容易受毒害，晋麦2号是相对耐As（Ⅲ）品种。

2.4 As（Ⅲ）半抑制浓度

为详细说明两种小麦对As（Ⅲ）的耐性差异，本研究依据As（Ⅲ）吸收试验开展了As（Ⅲ）对两种小麦半抑制浓度（EC）的分析，结果见表3。晋麦1 号、晋麦2 号根系生物量受半数抑制时的As（Ⅲ）浓度分别为1.2、2.2 μmol·L，这也解释了低浓度的As（Ⅲ）处理后，小麦根系生物量迅速降低的生理现象，该结果与李建秋等关于小麦受As毒害后的EC值相似。晋麦1号、晋麦2号根长受半数抑制时的As（Ⅲ）浓度分别为2.9、5.0 μmol·L，可能因为环境中存在的促进根长伸长的离子（如Ca），相对减缓了As（Ⅲ）对根长的抑制作用。晋麦1 号、晋麦2 号茎叶生物量受半数抑制时的As（Ⅲ）浓度分别为3.6、7.2 μmol·L，由于茎叶As的累积主要来源于根系的转运，而根系吸收的As 大部分固定在根部，仅有10%转运到地上部分，使得茎叶生物量受半数抑制时As（Ⅲ）浓度升高。晋麦1 号根系、茎叶的As（Ⅲ）半抑制浓度均显著低于晋麦2号，进一步说明晋麦1 号是As（Ⅲ）相对敏感品种，晋麦2 号是As（Ⅲ）相对耐受品种。

表3 不同浓度As（Ⅲ）处理后两种小麦根系生物量、根长及茎叶生物量的半抑制浓度Table 3 The EC50 of As concentration in root and shoot respectively of two wheat varieties under As（Ⅲ）treatments

2.5 吸收动力学特征及相关参数

吸收动力学曲线不仅能很好地反映小麦根系吸收As 的特征，还能有效说明两种小麦根系吸收As 的差异，更好地解释两种小麦对As 的耐性差异。由根系吸收动力学曲线（图4）得到小麦根系对As（Ⅲ）的最大吸收速率（，以鲜质量计）和米氏常数（）。由表4可知，晋麦1号的值低于晋麦2号，即晋麦2号根系对As（Ⅲ）的吸收速率较大；晋麦2 号的值低于晋麦1号，由于值越小，与离子的亲和力越大，对离子吸收强度越强，所以晋麦2号与As（Ⅲ）的亲和力较大，吸收As（Ⅲ）的能力较强。一般而言，累积的As越多，越容易受As 的毒害，而晋麦2 号根系对As（Ⅲ）的吸收累积能力强，但没有表现出毒害症状，进一步说明了晋麦2号是As（Ⅲ）耐受品种。

表4 As（Ⅲ）处理后两种小麦根系吸收动力学方程、参数和相关系数Table 4 As（Ⅲ）uptake kinetic equations and parameters of two wheat varieties

图4 不同As（Ⅲ）浓度处理后两种小麦根系吸收动力学曲线Figure 4 As（Ⅲ）uptake kinetics of two wheat varieties

2.6 氧化特征分析

为研究两种小麦受As 毒害的氧化胁迫生理特征，本研究对As（Ⅲ）处理后根系、茎叶中HO和MDA的含量进行了分析。结果表明两种小麦根系、茎叶中HO和MDA 均随As（Ⅲ）处理浓度的增加而增加（图5），说明两种小麦受As（Ⅲ）毒害后，体内活性氧代谢增加，使HO过量累积，过氧化反应加强，细胞膜受损程度严重，使MDA 的含量显著增加；晋麦1 号根系、茎叶中HO、MDA含量显著高于晋麦2号，说明晋麦1号受As毒害程度显著高于晋麦2号。

图5 不同浓度As（Ⅲ）处理后根系和茎叶中的H2O2和MDA含量Figure 5 Root and shoot H2O2 concentration under As（Ⅲ）treatments and root and shoot MDA concentration under As（Ⅲ）treatments of two wheat varieties

2.7 盆栽试验中P、Si 对晋麦2 号根系、茎叶生物量和As含量的影响

本研究模拟田间环境，通过盆栽试验说明P 肥和Si 肥对小麦As 吸收的减缓作用。由图6a 和图6b 可知，与CK 相比，添加P、Si 肥后根系生物量显著增加，且P2、Si2 处理根系生物量显著高于P1、Si1 处理，茎叶生物量也均显著增加，增加次序为P2＞Si2＞P1＞Si1。与CK 相比，P、Si 添加均能显著降低根系、茎叶中As的含量（图6c 和图6d），且P2、Si2 处理根系、茎叶As的含量均显著低于P1、Si1 处理，P2 处理根系、茎叶中As 含量分别较CK 降低了67.6%和49.2%，Si2 处理根系、茎叶中As含量分别降低了77.4%和60.5%。

图6 不同处理条件下根系、茎叶生物量和根系、茎叶As含量的变化Figure 6 The change of root and shoot biomass,root and shoot As concentration of wheat

As（Ⅲ）的水培试验结果充分证实了晋麦1 号是As（Ⅲ）相对敏感品种，一旦环境中有As（Ⅲ）存在，晋麦1 号易表现出毒害症状，较容易评价并能有效控制环境中的As 元素；晋麦2 号是As（Ⅲ）相对耐性品种，对As 的吸收、转运和累积能力较强，受As 毒害后产生的毒害症状不明显。作为田间广泛播种的小麦品种，晋麦2 号根系吸收的As 向茎叶部分转运，茎叶累积的As 进而向小麦籽粒中转运，成为潜在危害。因此，在小麦生长初期实施减少小麦As 累积的有效农艺措施，控制As向小麦地上部的迁移非常重要。

P、Si肥的添加不仅能增加小麦根系、茎叶的生物量，而且能显著降低As 含量。P 肥添加后，茎叶总As含量显著降低，该现象可以从地上部生物量稀释作用和地上部长距离运输两方面进行解释。史高玲等的研究表明，小麦籽粒As 的含量与茎秆中P 的含量呈负相关关系，P 能有效减少小麦对As 的吸收、转运和累积；NORTON 等在水稻研究中也得到了类似的结论。模拟田间试验的研究表明，随着土壤溶液氧化还原电位（Eh）的升高，As（Ⅲ）被氧化为As（Ⅴ），磷酸盐与As（Ⅴ）有相似的化学结构，从而产生竞争吸附，磷酸盐抑制小麦对As（Ⅴ）的吸收和转运，进而减少了As 向小麦地上部的转运。另外，有研究表明小麦籽粒中含有一定比例的As（Ⅴ），而小麦茎秆中较高的P 含量会导致籽粒中总As 含量降低，因此也可能因为P 是植物必需的大量元素，并且在植物体内移动性较强。增加P 的吸收和抑制As 的吸收是增加小麦抗As 能力的重要途径，As（Ⅴ）存在于好氧或氧化环境中，其可以被土壤中的矿物质如铁的氧化物、氢氧化物吸附，在高磷酸盐环境中，As（Ⅴ）会被大量吸收并留存在植物的木质部中；P 能通过抑制As（Ⅴ）的吸收来减缓As 对小麦的毒性，研究表明增加土壤中P 的含量，能显著降低小麦根系和茎叶中总As含量。P 强烈影响着土壤和生物体中As 的代谢。P 对植物细胞中As 的竞争吸附使P 肥的施加有效抑制了作物对As 的吸收和累积；而P 能活化土壤中As的吸附位点，P 肥的增加促进了土壤As 的释放。WU 等将“土壤-植物-微生物”作为一个整体解释了频繁发生的P-As 交互作用对系统中As 的转化、迁移所起的关键作用，P 的添加影响了As 的毒性，起到了对As的控制作用；研究还提出了在农业生产中将P肥施加在根际土壤中的施肥方式可以降低P 肥对土壤系统中As的活化作用。

施Si 肥可以竞争性地抑制As 在水稻体内的转运。Si 肥不仅能降低水稻籽粒对As 及其他重金属元素（如Cd、Pb 和Cr）的吸收，还能增加水稻的产量。DAS等通过盆栽试验表明Si肥的添加能激发土壤微生物的功能，不仅有利于水稻的生长，还能控制As 的生物有效性，减缓As 的毒害。GAO 等通过田间试验表明了Si 肥对稻田土壤中微生物的调节机制，Si能显著影响水稻根际及内圈土壤中微生物的多样性和丰度，将As固定在根系和根际表面，从而降低水稻对As 的吸收。DYKES 等的研究也表明，Si作为土壤改良剂能促使稻田土壤微生物群落成分的改变，增加甲基化基因的微生物组分，减缓As对作物的毒害。张世杰等的研究表明，在冬小麦拔节期叶面施Si 肥两次，能显著降低小麦籽粒中As 的含量，Si的添加能有效降低小麦茎叶中的As。Si对小麦吸收As的抑制作用可能是因为Si是植物生长的有益元素，外源添加Si 促进了小麦的生长，小麦植株生长旺盛，从而增强了其抵抗重金属的能力。SIL 等研究发现Si的增加能构建严格的细胞墙，以用于阻塞根质外体中As 的转运，这不仅能有效降低小麦苗期根系和茎叶中总As含量，而且增强了抗氧化酶的活性，减轻了氧化活性的影响，从而可以抵抗As 对小麦的影响，保障小麦的正常生长。

阻止重金属从植物根系向叶片的转运可能是植物对重金属耐受性的重要机理。因此，减少As 从植物根系向茎叶的转运是降低As对小麦毒性的重要途径。本研究充分表明P、Si 肥的添加减少了小麦根系对As 的吸收，使根系As 的累积量减少，向茎叶的转运能力降低，减缓了As 对小麦的毒性。由此可以得出P、Si肥的添加是减少小麦苗期As含量行之有效的农艺措施。