植物多酚或黄酮类的添加量对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响和机理

张秀花， 杨 光， 杨 波

上海理工大学 健康科学与工程学院， 上海 200093

猪肉是我国居民中最主要的肉类消费品之一，且能够给人提供丰富的蛋白质、矿物质和维生素等营养物质[1-2]。在日常生活中，猪肉的色泽也直接影响着消费者的购买欲及食欲。肌肉组织的pH、温度、脂肪氧化程度及肌红蛋白状态等因素都会影响猪肉的色泽[3]。亚硝酸盐常被用来作为肉制品的发色剂，使肉制品呈现稳定的红色[4]。但亚硝酸盐在酸性条件下可以与肉中的胺类物质发生亚硝基反应，转化成具有强癌性的N-亚硝基化合物[5]。因此，如何改善肉制品的色泽且能降低亚硝酸盐的残留量是食品工艺中研究的一项重要内容。

目前，已有大量研究表明植物提取物中含有的多酚及黄酮类化合物对亚硝酸盐具有一定的清除作用[6-8]。周亚军等[6]研究发现竹叶提取物能够改善低硝西式熏煮火腿的色泽，降低亚硝酸盐残留量。当添加质量分数为0.05%的竹叶提取物时，亚硝酸盐残留量最少，清除率为62.47%。郗远[7]研究发现添加1%～3%的蔓越莓粉末能够显著降低腌制猪肉的亚硝酸残留量，腌制9 d后，三个蔓越莓处理组与对照组相比亚硝酸盐残留浓度显著减少16 mg/kg～82 mg/kg。王永丽[8]利用茶多酚、葡萄提取物及姜辣素来研究腌制培根风干储藏过程中亚硝酸盐残留量的变化，研究表明在腌制时添加300 mg/kg的植物多酚(茶多酚和葡萄籽提取物)和生育酚，可以降低亚硝酸盐残留量，抑制其亚硝基化，控制N-二甲基亚硝胺的形成。已有研究表明：葡萄籽提取物中含有大量的原花青素，其抗氧化活性较高[9]；蓝莓提取物的主要成分是花青素，其属于酚类化合物中的类黄酮类[10]；而山楂提取物的主要成分为黄酮类[11]，三者都对亚硝酸盐有一定的清除效果。

因此，为进一步改善猪肉亚硝酸盐腌制品的色泽并降低亚硝酸钠的残留量，本文选用蓝莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黄酮三种植物多酚或黄酮进行复配，通过添加三种不同质量分数的植物多酚或黄酮来探究对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响，并通过单因素试验及响应面优化确定出这三种植物多酚或黄酮的适宜添加量，并对其影响色泽及亚硝酸钠残留量的机制进行初步探究，为加工肉制品提供一定的理论基础和参考依据，进一步提高肉制品品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：中方肉：购于上海沃尔玛超市，-18 ℃下冷冻贮存，待使用时将冷冻的猪肉于4 ℃下解冻12 h。葡萄籽提取物(原花青素含量≥95%)、蓝莓提取物(含花青素25%)，山东圣嘉德生物科技有限公司；山楂提取物(含山楂黄酮80%)，福建汇天生物药业有限公司；亚硝酸钠(食品级)，杭州龙山化工有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准品(纯度≥97%)，上海麦克林生化科技有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)、乙二胺四乙酸二钠、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺，分析纯，均在上海国药集团购买。

仪器：ER-RD7000CN东芝微波烤箱，泰国东芝电器制造有限公司；L5S紫外分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司；CS-600A分光测色仪，杭州彩谱科技有限公司；DK-S28型电热恒温水浴锅，上海华连医疗器械有限公司；LC-MSH-PRO恒温磁力搅拌器，邦西仪器科技(上海)有限公司，TDL-80-2B低速离心机，上海安亭科学仪器厂；Nicoletis10傅里叶变换红外光谱仪，美国THERMO FISHER公司。

1.2 方法

1.2.1原料肉的处理

将解冻后的猪肉切成大小为3 cm×2 cm×1.5 cm的肉片，加入质量分数为0.015%的亚硝酸钠，一定质量分数的蓝莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黄酮，加入50 mL水，搅拌均匀后放在4 ℃的冰箱中腌制12 h，将腌制后的猪肉用过热蒸汽进行加热，并设定好加热温度150 ℃，加热时间25 min，待猪肉加热完成后，迅速取样，冷却至室温时待测。

1.2.2a*的测定

将肉切成大小为2 cm×1 cm ×1 cm的肉片，放在白色背景板上，使用分光测色仪测定其红度值(a*)[12]。

1.2.3亚硝酸钠残留量的测定

按照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》分光光度法进行测定[13]。

1.2.4植物多酚或黄酮类的单因素试验

以猪肉亚硝酸钠腌制品红度值a*及亚硝酸钠残留量为指标，探究不同质量分数的植物多酚或黄酮(蓝莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黄酮)对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响，设计三因素五水平的单因素试验，因素水平如表1所示。样品处理同1.2.1。

表1 单因素试验因素水平表

1.2.5植物多酚或黄酮类的响应面法优化

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计进行优化分析，以蓝莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黄酮为影响因素，以猪肉亚硝酸钠腌制品红度值a*和亚硝酸钠残留量为响应值，并设计三因素三水平的响应面试验，因素水平见表2所示。样品处理同1.2.1。

表2 响应面设计因素水平表

1.2.6硫代巴比妥酸值(TBARS)的测定

参照唐彬等[14]测定TBA的方法并稍作修改。称取10 g肉样，并使其充分搅碎。加入50 mL的7.5%三氯乙酸混合液(含0.1% EDTA溶液)，摇匀，置于磁力搅拌器上50 ℃搅拌30 min，混合物用双层滤纸过滤。取滤液 5 mL，加 5 mL 0.02 mol/L TBA 溶液，100 ℃沸水浴中保持40 min，取出后用流动自来水冷却10 min，用紫外可见分光光度计在 532 nm 处测定反应溶液的吸光值。通过与标准曲线对照计算出TBA值，其结果用mg MDA/kg表示。

1.2.7肌红蛋白含量及高铁肌红蛋白相对含量测定

参考KRZYWICKI[15]的方法并稍作修改：称取5 g待测猪肉糜，加入25 mL浓度为0.04 mol/L、pH 6.8的磷酸缓冲液，并在室温下用恒温磁力搅拌器1 500 r/min 搅拌5 min。搅拌完成后，将其置于冰水浴中，静置1 h，4 ℃、3 500 r/min离心20 min，过滤，采用紫外分光光度计分别在525 nm、545 nm、565 nm和572 nm波长处测量其吸光度。计算肌红蛋白浓度及高铁肌红蛋白相对含量。

肌红蛋白浓度/(mmol/L)=-0.166A572 nm+0.086A565 nm+0.088A545 nm+0.099A525 nm

(1)

高铁肌红蛋白/%=(-2.514R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×100

(2)

式(2)中：R1、R2、R3分别为吸光度比值A572 nm/A525 nm、A565 nm/A525 nm、A545 nm/A525 nm。

1.2.8傅立叶变换红外光谱(FT-IR)测定

参考张登科等[16]的方法并稍作修改，取加热处理好的猪肉样品冷冻干燥后，采用KBr压片法，置于傅里叶变换近红外光谱上进行扫描，波长范围为4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.9数据处理与分析

每组试验重复3次，数据以平均值±标准差表示。运用Origin 2019b软件绘图，数据采用SPSS Statistics 25 软件进行统计学分析，用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计与分析。

2 结果与讨论

2.1 蓝莓花青素对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响

由图1可知，当蓝莓花青素的添加量在0.01%～0.05%时，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*呈上升趋势(P<0.05)。当蓝莓花青素的添加量在0.04%时，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*为9.01，此时得到的猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽较适宜、稳定性较好。当其添加量大于0.04%时，a*的变化没有显著性差异。随着蓝莓花青素添加量的增加，亚硝酸钠残留量呈下降趋势(P<0.05)。当蓝莓花青素的添加量0.04%，亚硝酸钠残留量降低至1.66 mg/kg。这一结果与魏萌等[17]研究的一致，蓝莓花青素属于酚类化合物中的类黄酮类[10]，这些物质可以与亚硝胺前体物质发生氧化还原反应，从而降低了肉制品中的亚硝酸盐残留量，抑制了亚硝胺的形成[18]。所以，综合考虑以蓝莓花青素添加量0.04%为最适添加量。

图1 蓝莓花青素对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响

2.2 葡萄籽原花青素对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响

由图2可知，葡萄籽原花青素添加量在0.02%～0.1%时。随着葡萄籽原花青素添加量的增加，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*呈上升趋势(P<0.05)，当加入质量分数为0.06%的葡萄籽原花青素时，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*达到8.96，且与对照组相比，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值明显加深。当葡萄籽原花青素的添加量大于0.06%时，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度过深而影响其食用价值。亚硝酸钠残留量随着葡萄籽原花青素添加量的增加呈下降趋势(P<0.05)。当葡萄籽原花青素的添加量为0.06%时，继续增加葡萄籽原花青素的用量，亚硝酸钠残留量降低不显著。葡萄籽原花青素是多酚类物质[19]。原花青素中含有大量的酚羟基，酚羟基可提供活泼性氢离子与亚硝酸盐反应，可将亚硝酸盐还原成一氧化氮,从而减少了亚硝酸的残留并提高肉的红色[20]。因此，综合考虑以葡萄籽原花青素的添加量0.06%为最适添加量。

图2 葡萄籽原花青素对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响

2.3 山楂黄酮对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响

由图3可知，当山楂黄酮的添加量在0.01%～0.05%时，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*呈上升趋势(P<0.05)，而亚硝酸钠残留量随着山楂提取物添加量的增加而呈下降趋势(P<0.05)。这与刘星[21]研究的结果一致。当山楂黄酮的添加量在0.03%时，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*已达到8.93，亚硝酸钠残留量降低至2.20 mg/kg，当其添加量大于0.03%时，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*与亚硝酸残留量变化不显著，考虑到节约成本且猪肉的颜色已达到理想状态，因此，山楂黄酮的最适添加量为0.03%。

图3 山楂黄酮对猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽及亚硝酸钠残留量的影响

2.4 响应面优化试验结果与分析

以蓝莓花青素(A)、葡萄籽原花青素(B)、山楂黄酮(C)为自变量，猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*(Y1)和亚硝酸残留量(Y2)为响应值进行RSM优化，其结果见表3。

表3 响应面设计及结果

利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行响应面分析，其显著性如表4和表5所示，对红度值a*和亚硝酸钠残留量进行回归分析，拟合得到三元二次回归方程：

表4 猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*响应面方差分析表

表5 亚硝酸钠残留量响应面方差分析表

Y1=8.97+0.34×A+0.51×B+0.33×C+0.28×AB+0.14×AC+(7.5×10-3)×BC-0.25×A2-0.33×B2-0.052×C2。

Y2=1.57-0.33×A-0.57×B-0.21×C-0.15×AB-0.042×AC+0.048×BC+0.27×A2+0.48×B2+0.082×C2。

表4和表5分别是对猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*和亚硝酸钠残留量回归模型进行的方差分析。由表4可知，模型P<0.000 1<0.01，说明Y1模型差异为极显著；失拟项P=0.225 1>0.05，说明相对于纯误差，失拟项不显著；同理，由表5可知，模型P<0.000 1<0.01，说明Y2模型差异为极显著；失拟项P=0.232 7>0.05，说明相对于纯误差，失拟项不显著；各模型的决定系数分别为R2=0.980 1、0.992 8，均较接近于1，说明该模型与实际数据拟合良好[22]，能够正确地反应出猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*、亚硝酸钠残留量与葡萄籽原花青素、蓝莓花青素和山楂黄酮的关系。

通过比较F值发现，三个因素对猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*及亚硝酸钠残留量的影响的显著性大小为葡萄籽原花青素>蓝莓花青素>山楂黄酮。利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析，当亚硝酸钠残留量处于最低水平时，且猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*居于合适范围内，植物多酚或黄酮类优的化化工艺如下：当蓝莓花青素的添加量为0.045%、葡萄籽原花青素的添加量为0.069%、山楂黄酮的添加量为0.025%，得到的猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*和亚硝酸残留量的理论值分别为9.10 mg/kg和1.40 mg/kg。

通过响应面优化分析，得出蓝莓花青素、葡萄籽原花青素与山楂黄酮三个因素及其交互作用对猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*及亚硝酸钠残留量的影响如图4所示。

(a) 蓝莓花青素与葡萄籽原花青素交互作用

(b) 蓝莓花青素与山楂黄酮交互作用

(c) 葡萄籽原花青素与山楂黄酮交互作用图4 各因素交互作用对猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*和亚硝酸钠残留量的影响

响应面曲面坡度陡峭程度可以反映出各因素对响应值的影响程度大小，坡度越陡，对响应值的影响越大[23]。由图4(a)可知，当固定山楂黄酮的添加量为0.03%时，葡萄籽原花青素对猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*和亚硝酸钠残留量的影响程度大于蓝莓花青素；同理，由图4(b)可知，当固定葡萄籽原花青素添加量为0.06%时，蓝莓花青素对猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*和亚硝酸钠残留量的影响程度大于山楂黄酮；由图4(c)可知，当固定蓝莓花青素添加量为0.04%时，葡萄籽原花青素对猪肉亚硝酸钠腌制品的红度值a*和亚硝酸钠残留量的影响程度大于山楂黄酮。

2.5 响应面试验最优条件验证

根据实际情况将工艺调整为：蓝莓花青素添加量为0.045%、葡萄籽原花青素添加量为0.069%、山楂黄酮添加量为0.025%，在此条件下进行验证，做三次重复试验，结果取平均值，测得的实际红度值a*为9.18，亚硝酸钠残留量1.56 mg/kg，该值与理论值相差较小，表明该模型具有可靠性。

2.6 植物多酚或黄酮类对猪肉硫代巴比妥酸值(TBARS)的影响

猪肉的色泽及亚硝酸钠残留量受到脂质氧化程度的影响[24]，丙二醛是动物脂质氧化分解的最终产物，与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成粉红色物质，其TBA值越大，表明猪肉氧化程度越高[25]。由图5可知，与对照组相比，所有试验组的TBA值较低，且复配植物多酚或黄酮类的TBA值低于单一植物多酚与黄酮，这与徐畅等[26]研究的结果一致，复配的植物多酚或黄酮的TBA值为0.14 mg MDA/kg。TBA值降低可能是由于植物多酚或黄酮类中含有的酚羟基与自由基相结合从而中断了自由基的链式反应，减少了氧化产物的产生[27]。可见，植物多酚或黄酮类对猪肉的脂质氧化有较好的抑制作用。

图5 植物多酚或黄酮类对猪肉硫代巴比妥酸值(TBARS)的影响

2.7 植物多酚或黄酮类对猪肉中肌红蛋白与高铁肌红蛋白含量的影响

降低肉中肌红蛋白血红素中铁原子的氧化，减少肌红蛋白向高铁肌红蛋白的转化是维持猪肉色泽稳定性的关键[28]。由图6(a)与(b)可知，与对照组相比，复配植物多酚或黄酮类的肌红蛋白浓度较高，高铁肌红蛋白含量最低。复配植物多酚或黄酮类比单一植物多酚或黄酮的使用效果更加明显，说明复配的植物多酚或黄酮可以有效改善肉制品的色泽稳定性。由于亚硝酸钠在肉中乳酸的作用下生成亚硝酸，亚硝酸即使在室温下也很不稳定，分解产生亚硝基，亚硝基很快与肌红蛋白作用生成鲜艳的红色亚硝基肌红蛋白[29]。植物多酚或黄酮类中含有的酚类物质具有抗氧化活性，既可以防止肌红蛋白的氧化，使其生成更多的亚硝基肌红蛋白，使猪肉呈色效果更佳，又可以发挥助色作用将高铁肌红蛋白还原成肌红蛋白[30]。

(a) 肌红蛋白

(b) 高铁肌红蛋白图6 植物多酚或黄酮类对猪肉中(a)肌红蛋白与(b)高铁肌红蛋白含量的影响

2.8 红外光谱分析

为了研究猪肉样品在用复配植物多酚或黄酮处理前后结构是否发生变化，测得猪肉的红外光谱如图7所示。

图7 对照组与复配植物多酚或黄酮红外光谱图

由图7可知，在 2 920 cm-1附近的吸收峰则是-CH的伸缩振动[31]。在1 500 cm-1～1 800 cm-1波段为蛋白质酰胺I、II带的特征吸收峰[32]。从图中可以看出，与对照组相比，在1 720 cm-1附近处的吸收峰变宽、强度增强以及1 750 cm-1附近的吸收峰发生偏移、吸收峰强度也在增强，这说明复配植物多酚或黄酮类的添加引起了猪肉中蛋白质二级结构的变化。

3 结论

通过单因素和响应面优化试验，得出了复配植物多酚或黄酮类的优化参数：当蓝莓花青素添加量为0.045%、葡萄籽原花青素添加量为0.069%、山楂黄酮添加量为0.025%，得到的a*为9.18，亚硝酸钠残留量1.56 mg/kg，此时得到的猪肉亚硝酸钠腌制品色泽稳定性较好，且亚硝酸钠残留量较低。通过对猪肉硫代巴比妥酸值脂质氧化程度与肌红蛋白、高铁肌红蛋白含量的分析，可以看出复配植物多酚或黄酮类相较于单一植物多酚或黄酮有更好的抗氧化效果，能够抑制脂质的氧化和减少高铁肌红蛋白的生成量，从而使猪肉制品赋予良好的色泽。通过红外光谱的分析结果可知，复配的植物多酚或黄酮类的添加引起了猪肉中蛋白质二级结构的变化，因此，植物多酚或黄酮类不仅能够有效改善猪肉亚硝酸钠腌制品的色泽，同时也可降低亚硝酸盐的残留，为加工肉制品的安全提供理论依据。