血清miR-106、CCL2水平与糖尿病视网膜病变微血管损伤的关系

胡强，栾兰，陆璐

十堰市人民医院眼科，湖北十堰 442000

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一，随着病程进展会引起患者视力下降甚至失明［1-2］。因此，DR 早期诊断和有效治疗至关重要。微小RNA（miRNA）是一类非编码RNA分子，能够参与细胞增殖、迁移、凋亡等生物学过程，与DR 的发生、发展密切相关［3］。miR-106 是miRNA家族成员之一。有研究报道，miR-106 在高糖诱导的血管内皮细胞中表达下调，上调miR-106 表达则抑制高糖诱导的血管内皮细胞损伤［4］。结果提示，miR-106 可能参与DR 的发生、发展。C-C 基序趋化因子配体2（CCL2）是一种前炎症细胞因子，能够上调多种炎症介质表达。有研究报道，DR患者玻璃体和血液CCL2 水平显著升高［5］，表明CCL2 亦参与DR的发生、发展。但目前miR-106、CCL2 与DR 患者微血管损伤的关系尚不明确。本研究探讨了血清miR-106、CCL2水平与DR微血管损伤的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年10月—2021年6月十堰市人民医院收治的2 型糖尿病患者206 例，男126例、女80 例，年龄32～78（57.09 ± 6.71）岁，BMI 21～29（24.26 ± 2.39）kg/m2，中位糖尿病病程11（6，15）年。纳入标准：①符合《中国2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》［6］中的诊断标准；②年龄≥18 岁；③临床资料完整。排除标准：①合并除DR 外的其他微血管病变或大血管病变者；②合并心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍者；③合并视神经疾病、视网膜静脉阻塞、青光眼、白内障等眼部疾病者；④合并甲状腺功能亢进、皮质醇增多症等影响糖代谢疾病者；⑤先天性弱视者；⑥合并恶性肿瘤者；⑦合并急慢性感染性疾病者；⑧合并免疫系统或血液系统疾病者。根据是否合并DR 及其视网膜病变程度分为无糖尿病视网膜病变（NDR）82 例（NDR 组）、非增殖性糖尿病视网膜病变（NPDR）68例（NPDR 组）、增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）56 例（PDR 组）。DR 诊断依据《糖尿病视网膜病变防治专家共识》［7］，若伴有新生血管形成、玻璃体积血、视网膜前出血即为PDR。其中，NDR 组男54 例、女28例，年龄（57.39±7.34）岁，BMI（24.67 ± 2.36）kg/m2；NPDR 组男37例、女31 例，年龄（55.60 ± 6.09）岁，BMI（23.91 ±2.51）kg/m2；PDR 组男35 例、女21 例，年龄（58.45±6.21）岁，BMI（24.07 ± 2.21）kg/m2。三组性别、年龄、BMI 具有可比性。本研究经十堰市人民医院医学伦理委员会批准（批准文号：THPH2101SY），患者或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 血清miR-106、CCL2、IL-6、TNF-α 检测 所有研究对象入院次日采集清晨空腹肘静脉血6 mL，3 000 r/min 离心10 min、离心半径10 cm，留取上层血清，-80 ℃冰箱保存。取部分血清，采用TRIzol 法抽提血清总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按TaKaRa 逆转录试剂盒说明将总RNA 逆转录为cDNA。逆转录条件：42 ℃1 h，95 ℃5 min。以cDNA 为模板，按实时荧光定量PCR 试剂盒说明进行PCR 扩增。引物序列由北京深蓝云生物科技有限公司设计合成。引物序列：miR-106 上游引物5"-GGGCTAAAGTGCTGACAGTGC-3"、下 游引 物5"-GTGCAGGGTCCGAGGT-3"，扩增片段长度84 bp；U6 上游引物5"-GCUUCGGCAGCACAUAUACUAAA-3"、下 游 引 物5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3"，扩增片段长度582 bp。PCR 反应体系共10 μL：cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Master Mix 3 μL，ddH2O 5 μL；反应条件：95 ℃90 s，95 ℃30 s、63 ℃30 s、72 ℃15 s共40个循环。PCR 反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT法计算血清miR-106水平。

剩余血清采用ELISA 法检测血清CCL2、IL-6、TNF-α。检测仪器为多功能微孔板检测仪，试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司。所有操作严格按仪器操作规程和试剂盒说明进行。

1.3 外周血循环祖细胞（CPC）、内皮祖细胞（EPC）、循环内皮细胞（CEC）比例及空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、餐后2 h血糖（2 h PG）检测 所有研究对象入院次日采集清晨空腹肘静脉血6 mL，采用CytoFLEX S 流式细胞仪检测外周血CPC、EPC、CEC 比例，采用葡萄糖氧化酶法检测FPG，采用乳胶凝集反应法检测HbA1c，并通过口服葡萄糖耐量试验检测2 h PG。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。正态分布的计量资料以±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验；偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用H 检验，进一步两两比较采用Bonferroni 校正检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 或Spearman 相关分析法。危险因素分析采用多因素Logistic 回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清miR-106、CCL2、IL-6、TNF-α 水平及外周血CPC、EPC、CEC比例比较 见表1、2。

表1 三组血清miR-106、CCL2、IL-6、TNF-α水平比较

2.2 DR 患者血清miR-106、CCL2 水平与外周血CPC、EPC、CEC 比例及血清IL-6、TNF-α 水平的关系 相关性分析显示，DR患者血清miR-106水平与外周血CPC、EPC比例呈正相关关系（r分别为0.474、0.453，P均＜0.05），与外周血CEC 比例及血清IL-6、TNF-α 水平呈负相关关系（r 分别为-0.466、-0.429、-0.508，P均＜0.05）；血清CCL2 水平与外周血CPC、EPC 比例 呈 负 相 关 关 系（r 分 别 为-0.508、-0.465，P均＜0.05），与外周血CEC 比例和血清IL-6、TNF-α 水平呈正相关关系（r 分别为0.475、0.493、0.419，P均＜0.05）；血清miR-106水平与血清CCL2水平呈负相关关系（r=-0.534，P＜0.05）。

表2 三组外周血CPC、EPC、CEC比例比较（%）

2.3 2型糖尿病患者进展至DR或PDR的影响因素分析 三组糖尿病病程、FPG、HbA1c、2 h PG比较见表3。以miR-106、CCL2 为自变量，以糖尿病病程、FPG、2 h PG、HbA1c为协变量，以是否发生DR或PDR（是=1，否=0）为因变量，纳入多因素Logistic回归模型。结果发现，糖尿病病程、2 h PG、HbA1c、CCL2是2型糖尿病患者进展至DR 或PDR 的独立危险因素，而miR-106则为其独立保护因素（P均＜0.05）。见表4、5。

表3 三组糖尿病病程、FPG、2 h PG、HbA1c比较

表4 2型糖尿病患者进展至DR的多因素Logistic回归分析结果

表5 2型糖尿病患者进展至PDR的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

DR 是糖尿病常见的微血管并发症之一。随着糖尿病病程延长或长期血糖控制不佳，血糖渗入眼部基底膜，损伤视网膜微血管，进而引起患者视力下降甚至失明［8］。糖尿病微血管损伤是一个复杂的全身性病理生理过程，炎症反应在其中发挥至关重要的作用。有研究认为，IL-6、TNF-α 等炎症因子能够通过直接损伤血管内皮和增加组织水肿及毛细血管渗漏等引起微血管损伤［9］。CPC 和EPC 能够参与血管再生和血管内皮损伤后修复，CEC 是成熟内皮细胞在血管内皮损伤后从血管壁脱落进入血液循环的细胞。因此，CPC、EPC 比例降低和CEC 比例升高能够反映微血管内皮损伤［10-11］。本研究结果证实，PDR组、NPDR 组血清IL-6、TNF-α 水平及外周血CEC 比例高于NDR 组，而外周血CPC、EPC 比例低于NDR组；PDR 组血清IL-6、TNF-α 水平及外周血CEC 比例高于NPDR 组，而外周血CPC、EPC 比例低于NPDR组。提示炎症反应能够参与糖尿病微血管损伤，而微血管损伤是糖尿病进展至DR或PDR的病理基础。

miRNA 是一类长度约22 个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，能够与靶mRNA 的3′非翻区特异性结合，从而降解靶mRNA 或阻碍靶mRNA 翻译。有研究报道，miR-199a-3p能够通过靶向成纤维细胞生长因子7和抑制表皮生长因子受体/PI3K/AKT 信号通路激活，抑制内皮细胞损伤，延缓糖尿病微血管并发症进展［12］。结果提示，miRNA 能够参与DR 的发生、发展。miR-106 是miRNA 家族成员之一。LIAN 等［13］在脂多糖诱导的子宫内膜炎中发现，miR-106 能够通过靶向下调有丝分裂原活化蛋白激酶14表达和抑制NF-κB 表达，进而抑制IL-1、TNF-α 等炎症因子分泌；WANG 等［14］在MAPK 信号通路抑制剂SB203580 诱导的妊娠期高血压中发现，miR-106 能够通过抑制MAPK信号通路抑制妊娠期高血压小鼠肝脏炎症浸润。上述研究证实，miR-106 能够参与炎症反应过程。本研究结果显示，PDR 组血清miR-106 水平低于NPDR 组、NDR 组，NPDR 组血清miR-106 水平低于NDR 组，提示miR-106 能够参与DR 的发生、发展。进一步研究发现，DR 患者血清miR-106 水平与外周血CPC、EPC 比例呈正相关关系，与CEC 比例和血清IL-6、TNF-α 水平呈负相关关系。LIU 等［4］在高血糖诱导的血管内皮细胞功能障碍模型中发现，miR-106 能够靶向下调高迁移率族蛋白B1而抑制IL-6、TNF-α表达，逆转高血糖诱导的血管内皮损伤。进一步证实，miR-106 可能通过炎症反应参与糖尿病微血管损伤。

趋化因子是一类能够趋化细胞定向移动的小分子分泌蛋白。CCL2 为趋化因子C-C 亚家族成员之一，主要由血管内皮细胞活化后产生，能够诱导中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞迁移和浸润［5］。DONG 等［15］研究报道，2 型糖尿病患者房水中CCL2水平与DR病情程度、黄斑水肿程度、黄斑厚度等密切相关。王新婷等［16］研究报道，PDR 患者玻璃体液中CCL2 水平升高，通过玻璃体腔内注射曲安奈德降低CCL2 水平能够改善患者视力。以上研究提示，CCL2可能参与DR的发生、发展。本研究结果显示，PDR 组血清CCL2 水平显著高于NPDR 组、NDR 组，NPDR 组血清CCL2 水平高于NDR 组，结果表明CCL2 能够参与DR 的发生、发展。进一步研究发现，DR 患者血清CCL2水平与外周血CPC、EPC 比例呈负相关关系，与外周血CEC 比例和血清IL-6、TNF-α水平呈正相关关系。众所周知，中性粒细胞、巨噬细胞浸润是炎症性疾病的一个重要特征。CCL2可通过募集中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞进入视网膜，促进视网膜炎症反应，从而引起微血管损伤。有研究报道，DR小鼠视网膜存在明显的巨噬细胞浸润，通过注射CCL2 抑制剂能够抑制DR 小鼠视网膜巨噬细胞浸润，改善视网膜血管通透性［17］。提示CCL2可能通过炎症反应参与DR微血管损伤。

本研究多因素Logistic 回归分析发现，CCL2 是2 型糖尿病患者进展至DR 或PDR 的独立危险因素，而miR-106则为其独立保护因素。进一步证实，miR-106、CCL2 均能参与DR 的发生、发展。本研究结果还发现，DR 患者血清miR-106 水平与血清CCL2 水平呈负相关关系。田涛等［18］在高糖诱导的PDR 模型中通过双荧光素酶报告基因实验证实，miR-106 能够靶向抑制CCL2 表达，进而抑制PDR 视网膜微血管内皮细胞炎症反应。因此，miR-106 可能通过靶向抑制CCL2参与DR的发生、发展。

综上所述，DR 患者血清miR-106 水平降低、血清CCL2 水平升高，二者可能通过炎症反应共同参与DR 微血管损伤；miR-106、CCL2 是2 型糖尿病患者进展至DR或PDR的独立影响因素。