顶空气相色谱法测定阿尼芬净关键原料对戊氧基三联苯甲酸中的残留溶剂

安兰兰，张 晴，仲伟潭，祝仕清，李 敏，马 岩

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050000)

阿尼芬净(Anidulafungin)是第三代棘白霉素类半合成抗真菌药，由美国Vicuron制药公司研制，于2006年在美国上市[1]。阿尼芬净的独特结构(图1)使其较其它棘白霉素类抗真菌药具有更大的分布容积和更广谱的抗菌活性。阿尼芬净不经肝代谢和肾消除，用药安全，耐受性好，在临床上具有良好的应用前景[1-3]。

图1 阿尼芬净的结构式Fig.1 Structural formula of Anidulafungin

对戊氧基三联苯甲酸(图2)是合成阿尼芬净的关键起始原料，其合成工艺[4]中需使用正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙基苯、二甲苯(对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯)、二甲基亚砜、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺等有机溶剂。根据《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》，应对对戊氧基三联苯甲酸中有机溶剂残留量进行检测与控制。鉴于此，作者根据ICH Q3C(R8)、《中华人民共和国药典》通则[5]及相关文献[6-10]建立测定对戊氧基三联苯甲酸中残留溶剂的顶空气相色谱法(headspace gas chromatography，HS-GC)，并进行方法学验证。

图2 对戊氧基三联苯甲酸的结构式Fig.2 Structural formula of p-pentyloxytribenzoic acid

1 实验

1.1 试剂与仪器

对戊氧基三联苯甲酸，天津狄克特公司；1-羟基苯并三氮唑(HOBT)，纯度99.0%，苏州昊帆公司；四氢呋喃对照品(分析纯)，纯度99.0%，天津瑞金特化学品有限公司；乙酸乙酯对照品(分析纯)，纯度99.5%，天津光复科技发展有限公司；正己烷对照品、二甲基亚砜对照品均为色谱纯，纯度99.5%，天津科密欧化学试剂有限公司；乙基苯对照品、对二甲苯对照品、邻二甲苯对照品、间二甲苯对照品均为色谱纯，纯度99.5%，山东西亚化学工业有限公司；吡咯烷酮(色谱纯)。

7890A型气相色谱仪、7697型顶空进样器(氢火焰离子化检测器，FID)，Agilent公司；LabSolutions色谱工作站，日本岛津公司；XA205型电子天平(精密度十万分之一)，瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 溶液的配制

空白溶液：精密称取HOBT 0.094 g，置于20 mL顶空瓶中，加入吡咯烷酮5 mL，压盖密封。

混合对照溶液：分别精密称取适量正己烷对照品、四氢呋喃对照品、乙基苯对照品、对二甲苯对照品、邻二甲苯对照品，以吡咯烷酮制成含正己烷2.42 mg·mL-1、四氢呋喃6.00 mg·mL-1、乙基苯3.07 mg·mL-1、对二甲苯2.53 mg·mL-1、邻二甲苯1.63 mg·mL-1的混合溶液；分别精密称取适量乙酸乙酯对照品和二甲基亚砜对照品，加入适量混合溶液，以吡咯烷酮制成含正己烷145 μg·mL-1、乙酸乙酯2.5 mg·mL-1、四氢呋喃360 μg·mL-1、乙基苯184 μg·mL-1、对二甲苯152 μg·mL-1、邻二甲苯98 μg·mL-1、二甲基亚砜2.5 mg·mL-1的混合对照母液；精密量取混合对照母液适量，以吡咯烷酮稀释10倍，得含正己烷14.5 μg·mL-1、乙酸乙酯250 μg·mL-1、四氢呋喃36 μg·mL-1、乙基苯18.4 μg·mL-1、对二甲苯15.2 μg·mL-1、邻二甲苯9.8 μg·mL-1、二甲基亚砜250 μg·mL-1的混合对照溶液；精密量取5 mL混合对照溶液，置于20 mL顶空瓶中，压盖密封。

供试溶液：分别精密称取对戊氧基三联苯甲酸0.25 g、HOBT 0.094 g，置于20 mL顶空瓶中，加入吡咯烷酮5 mL，压盖密封。

1.3 色谱条件

色谱柱采用以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷(DB-624)为固定液的毛细管柱(30 m×530 μm,3 μm)；升温程序：初始温度60 ℃，保持1 min；以10 ℃·min-1升温至95 ℃，保持6 min；以15 ℃·min-1升温至140 ℃，保持7 min；以30 ℃·min-1升温至240 ℃，保持10 min；进样口温度240 ℃；载气为高纯氮气；恒定流速1.5 mL·min-1；分流比20∶1；FID温度250 ℃，补充载气30 mL·min-1；顶空瓶平衡温度130 ℃，平衡时间40 min；进样定量管1 000 μL，进样时间0.5 min。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适用性和专属性

取吡咯烷酮5 mL置于顶空瓶中，分别加入适量目标溶剂正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙基苯、间二甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、二甲基亚砜，压盖密封，进行HS-GC分析，保留时间分别为7.823 min、8.799 min、9.374 min、16.691 min、16.938 min、16.957 min、18.020 min、18.784 min。由于间二甲苯、对二甲苯的保留时间相近，其色谱峰不能有效分离，而对二甲苯的控制限度低，故以对二甲苯的限度控制间二甲苯及对二甲苯的加和量。

取空白溶液、混合对照溶液、供试溶液进样分析，其顶空气相色谱图如图3所示。

由图3可知，在色谱条件下，各组分均能达到基线分离，分离度均大于1.5，达到药典要求，理论塔板数为68 353(以正己烷峰计)。表明，其它组分对测定无干扰，该方法专属性强。

1.正己烷 2.乙酸乙酯 3.四氢呋喃 4.乙基苯

2.1.2 线性关系

配制混合对照溶液，稀释，使各目标溶剂最高浓度分别为其限度的200%，最低浓度分别为其定量限。以各目标溶剂浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程，结果见表1。

由表1可知，7种目标溶剂的浓度与峰面积线性关系良好，相关系数均在0.999以上。

表1 回归方程及线性范围(n=6)

2.1.3 定量限及检测限

配制混合对照溶液，逐级稀释，连续进样测定6次。按信噪比S/N≥10计算定量限，信噪比S/N≥3计算检测限。测得正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙基苯、对二甲苯、邻二甲苯、二甲基亚砜的定量限分别为0.036 μg·mL-1、0.38 μg·mL-1、0.18 μg·mL-1、0.74 μg·mL-1、0.62 μg·mL-1、0.80 μg·mL-1、20.11 μg·mL-1，检测限分别为0.015 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.06 μg·mL-1、0.37 μg·mL-1、0.31 μg·mL-1、0.30 μg·mL-1、7.54 μg·mL-1。

2.1.4 精密度

配制混合对照溶液，连续进样测定6次。测得正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙基苯、对二甲苯、邻二甲苯、二甲基亚砜峰面积的RSD值(n=6)分别为4.2%、4.3%、3.8%、5.1%、5.1%、5.3%、4.5%，均小于10%。表明该方法精密度较好。

2.1.5 重复性

取对戊氧基三联苯甲酸(批号20190608)适量，配制6份供试溶液，进行HS-GC分析。供试溶液中仅检出微量的对二甲苯、邻二甲苯，残留量分别为0.0038%、0.0024%，RSD值(n=6)分别为 3.1%、4.4%，均小于5%。表明该方法重复性较好。

2.1.6 加标回收率

分别精密称取对戊氧基三联苯甲酸(批号20190608)0.25 g、HOBT 0.094 g，共10份，其中1份加入5 mL吡咯烷酮，作为空白溶液；另外9份分别加入低(50%)、中(100%)、高(150%)3个水平的混合对照溶液5 mL，每个加标水平各3份；以混合对照溶液作为对照，进行HS-GC分析，按外标法计算加标回收率，结果见表2。

表2 加标回收率结果(n=9)/%

由表2可知，7种目标溶剂的平均加标回收率分别为89.23%、95.80%、94.74%、95.82%、92.45%、92.80%、104.47%，RSD值分别为4.1%、3.7%、3.2%、5.2%、4.4%、4.3%、3.4%。

2.1.7 稳定性

配制6份混合对照溶液，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h进样，进行HS-GC分析。测得正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙基苯、对二甲苯、邻二甲苯、二甲基亚砜峰面积的RSD值(n=6)分别为4.2%、4.3%、3.8%、5.1%、5.1%、5.3%、4.5%，均小于10%。表明混合对照溶液在12 h内稳定。

2.2 实际样品测定

取3批对戊氧基三联苯甲酸样品，配制供试溶液，进行HS-GC分析，按外标法计算样品中残留溶剂含量，结果见表3。

表3 不同批次样品测定结果/%

由表3可知，3批对戊氧基三联苯甲酸样品中仅检出少量的对二甲苯和邻二甲苯，残留量分别为0.004%、0.002%，均低于限度要求，其它溶剂未检出。

2.3 讨论

2.3.1 溶剂的选择

由于对戊氧基三联苯甲酸溶解性较差，分别考察了其在水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、吡咯烷酮溶液、N,N-二甲基甲酰胺-吡咯烷酮混合溶液、HOBT-吡咯烷酮混合溶液、碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液中的溶解性，发现对戊氧基三联苯甲酸在HOBT-吡咯烷酮混合溶液中能完全溶解，且对测定没有干扰，而在其它溶剂中均不能完全溶解。因此，选用HOBT-吡咯烷酮混合溶液作为溶剂。

2.3.2 顶空条件的优化

分别考察了顶空平衡温度(120 ℃、130 ℃、140 ℃)、平衡时间(30 min、40 min、50 min)对样品测定结果的影响。结果发现，平衡温度为130 ℃时，平衡时间超过40 min后，顶空瓶中气液两相已达到平衡，为缩短分析时间，选择顶空平衡温度130 ℃、平衡时间40 min。

由于正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙基苯、对二甲苯、邻二甲苯、二甲基亚砜等7种目标溶剂的极性相差较大，因此采用了3次程序升温过程，能较好地分离目标溶剂，大大缩短了分析时间，满足了检测要求。

3 结论

建立了同时测定阿尼芬净关键原料对戊氧基三联苯甲酸中7种残留溶剂(正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙基苯、对二甲苯、邻二甲苯、二甲基亚砜)的顶空气相色谱法，并进行方法学验证。结果表明，7种残留溶剂的浓度与峰面积线性关系良好，相关系数均在0.999以上；7种残留溶剂的平均加标回收率分别为89.23%、95.80%、94.74%、95.82%、92.45%、92.80%、104.47%，RSD值分别为4.1%、3.7%、3.2%、5.2%、4.4%、4.3%、3.4%。该方法操作简单、灵敏度高、准确性高、专属性强，可用于对戊氧基三联苯甲酸中残留溶剂的测定，为对戊氧基三联苯甲酸的质量控制提供了依据。