克拉玛依桑枝提取物的抗氧化及抑菌活性研究

李金芳，崔 洁，陈晴晴，郝 治，骈继鑫*

(1.新疆第二医学院，新疆 克拉玛依 834000；2.新疆维吾尔自治区教育厅，新疆 乌鲁木齐830000)

桑枝为桑树的嫩枝，具有清热祛风、生津消渴、降血压等功效。《本草再新》中记载桑枝“壮肺气，燥湿，滋肾水，通经”；《本草备要》中记载桑枝“利关节，养津液，行水祛风”；《医部全录》中记载桑枝“逐湿，令人瘦，过肥者宜久服之”[1]。

桑枝中含有丰富的天然活性物质，如挥发油、多糖、黄酮和生物碱等。桑枝中还富含纤维素，可用作栽培食用菌的原料[2-4]。桑枝中的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)具有降血糖、降脂、抗肿瘤、抗病毒和抗癌等作用[5-7]，是目前的研究热点。刘鑫彤等[8]利用大孔树脂分离纯化桑枝多酚，得到桑皮苷A和桑皮黄素，通过DPPH法和ABTS法测试发现，其具有较强的抗氧化活性。钟雪敏等[9]从鲁桑枝的90%乙醇提取物中分离得到6个黄酮类成分，其中3个黄酮类成分是首次分离得到。王晶洁[10]用桑枝多糖治疗2型糖尿病大鼠，发现桑枝多糖不仅可以降低血糖、改善血管内皮细胞代谢，还可以保护心肌及肾功能。黄倩等[11]研究发现，桑枝多糖预防性给药能够改善小鼠肾缺血再灌注损伤，减轻炎症。

目前，关于新疆桑枝提取物活性的研究报道较少。为此，作者以克拉玛依桑枝为研究对象，分别使用水、乙醇提取桑枝的活性成分，通过测定桑枝提取物对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除率及还原能力，评价其抗氧化活性；并研究桑枝提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，为新疆桑蚕产业的发展提供一定的研究基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

桑枝饮片(批号161116)，安徽百禾堂中药饮片有限公司；桑枝，采自新疆克拉玛依。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基，批号S21J11M116469)，源叶生物；水杨酸(批号20180604)、抗坏血酸(VC，批号20200421)、氯化钠(批号20201011)，分析纯，天津盛奥化学试剂有限公司；硫酸亚铁(批号P1622613)、铁氰化钾(批号P1639458)、三氯化铁(批号P1606058)、三氯乙酸(批号P1671997)、过硫酸钾(批号P1646704)，分析纯，DAMAS-BETA；PBS缓冲溶液(0.01 mol·L-1，pH值7.2～7.4，批号20201020)，Solarbio；ABTS[2,2′-联氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，HPLC纯度≥98%，批号P1849860]，Sigma-Aldrich；无水乙醇(批号20151008)，分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司；酵母浸粉(批号01-012)、琼脂粉(批号01-023)，生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；胰蛋白(批号1462110)，生物试剂，Oxoid。

UV1801G型紫外可见分光光度计，天津冠泽科技有限公司；LE204E型电子天平(万分之一)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；YP202N型电子天平(百分之一)，上海菁海仪器有限公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；BGZ-140型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；KQ-700DEX型超声仪，昆山超声仪器有限公司；PHSJ-3F型pH计，上海仪电科学股份有限公司；N-1300D型旋转蒸发仪，东京理化；FW135型高速万能粉碎机，北京永光明医疗仪器有限公司；Eco-S15UV型实验室纯水系统，上海和泰仪器公司；THZ-82B型气浴恒温振荡器，金坛开发区吉特实验仪器厂；LDZF-30L型立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2 桑枝提取物的制备

桑枝水提物：分别将桑枝饮片和克拉玛依桑枝进行预处理后，在pH值为2.5、提取温度为65 ℃、液料比为30∶1 (mL∶g，下同)、提取功率为300 W、提取时间为30 min的最佳条件下提取其中的活性成分，分别得到桑枝饮片水提物(简称Y/水)、克拉玛依桑枝水提物(简称K/水)。

桑枝醇提物：分别将桑枝饮片和克拉玛依桑枝进行预处理后，在乙醇体积分数为70%、提取温度为60 ℃、液料比为20∶1、提取功率为280 W、提取时间为30 min的最佳条件下提取其中的活性成分，分别得到桑枝饮片醇提物(简称Y/醇)、克拉玛依桑枝醇提物(简称K/醇)。

1.3 桑枝提取物的抗氧化活性评价

1.3.1 样品溶液的制备

(1)桑枝饮片水提物溶液的配制：精密称取桑枝饮片水提物0.050 2 g置于25 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为2.0 mg·mL-1的桑枝饮片水提物储备液；再用蒸馏水依次稀释成浓度(mg·mL-1)分别为1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的样品溶液，备用。

(2)桑枝饮片醇提物溶液的配制：精密称取桑枝饮片醇提物0.021 0 g置于10 mL容量瓶中，加适量70%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为2.1 mg·mL-1的桑枝饮片醇提物储备液；再用70%乙醇依次稀释成浓度(mg·mL-1)分别为2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的样品溶液，备用。

(3)克拉玛依桑枝水提物溶液的配制：精密称取克拉玛依桑枝水提物0.021 2 g置于10 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为2.1 mg·mL-1的克拉玛依桑枝水提物储备液；再用蒸馏水依次稀释成浓度(mg·mL-1)分别为2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的样品溶液，备用。

(4)克拉玛依桑枝醇提物溶液的配制：精密称取克拉玛依桑枝醇提物0.020 8 g置于10 mL容量瓶中，加适量70%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为2.08 mg·mL-1的克拉玛依桑枝醇提物储备液；再用70%乙醇依次稀释成浓度(mg·mL-1)分别为2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4的样品溶液，备用。

(5)VC溶液的配制：精密称取VC 0.020 0 g置于10 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为2.0 mg·mL-1的VC储备液；再用蒸馏水依次稀释成浓度(mg·mL-1)分别为1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02的样品溶液，备用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定[12]

DPPH自由基溶液的配制：精密称取DPPH粉末8.001 5 g置于100 mL棕色容量瓶中，加适量无水乙醇溶解并定容至刻度，4 ℃保存，备用。

DPPH自由基清除率的测定：精密移取不同浓度的样品溶液各3.00 mL置于10 mL具塞试管中，加入DPPH自由基溶液3.00 mL，混匀，暗处放置30 min，用紫外可见分光光度计测定512 nm处吸光度(A1)。以等体积无水乙醇代替样品溶液，同法操作，测定其吸光度(A0)。按式(1)计算DPPH自由基清除率：

(1)

1.3.3 羟基自由基清除能力的测定[13]

9 mmol·L-1FeSO4·7H2O溶液的配制：精密称取FeSO4·7H2O 0.125 1 g置于50 mL棕色容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存，备用。

8.8 mmol·L-1H2O2溶液的配制：精密移取30%H2O21.5 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存，备用。

9 mmol·L-1水杨酸溶液的配制：精密称取水杨酸0.120 0 g置于100 mL容量瓶中，加适量无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存，备用。

羟基自由基清除率的测定：精密移取不同浓度的样品溶液各150 μL置于10 mL具塞试管中，依次加入9 mmol·L-1水杨酸溶液100 μL、9 mmol·L-1FeSO4·7H2O溶液100 μL、蒸馏水1 050 μL，摇匀后，再加入8.8 mmol·L-1H2O2溶液100 μL，37 ℃恒温反应15 min，用紫外可见分光光度计测定510 nm 处吸光度(A1)。以等体积蒸馏水代替样品溶液，同法操作，测定其吸光度(A0)；以等体积蒸馏水代替H2O2溶液，同法操作，测定其吸光度(A2)；以相同浓度VC溶液作为阳性对照。按式(2)计算羟基自由基清除率：

(2)

1.3.4 还原能力的测定[13]

1%铁氰化钾溶液的配制：精密称取铁氰化钾1.000 0 g置于100 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存，备用。

0.1%三氯化铁溶液的配制：精密称取三氯化铁0.050 2 g置于50 mL棕色容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存，备用。

10%三氯乙酸溶液的配制：精密称取三氯乙酸5.000 1 g置于50 mL棕色容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存，备用。

还原能力的测定：精密移取不同浓度的样品溶液各1 mL置于10 mL具塞试管中，依次加入PBS缓冲溶液2 mL、1%铁氰化钾溶液1.5 mL，摇匀，50 ℃恒温水浴20 min，置于冷水中快速冷却至室温；再加入10%三氯乙酸溶液1 mL，混匀后，取2 mL置于另一支10 mL具塞试管中，加入0.1%三氯化铁溶液2 mL，摇匀，立即测定700 nm处吸光度。以吸光度表征还原能力，吸光度越大，还原能力越强[14]。以蒸馏水代替样品溶液，同法操作，作为空白对照；以相同浓度VC溶液作为阳性对照。

1.3.5 ABTS自由基清除能力的测定[15]

2.45 mmol·L-1过硫酸钾溶液的配制：精密称取过硫酸钾0.033 1 g置于50 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存，备用。

ABTS自由基工作液的配制：精密称取ABTS粉末0.096 0 g置于装有25 mL 2.45 mmol·L-1过硫酸钾溶液的烧杯中，溶解后，转移至50 mL棕色容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，室温避光静置24 h，即得ABTS自由基储备液；将ABTS自由基储备液用无水乙醇稀释至734 nm处吸光度为0.70±0.05,即得ABTS自由基工作液。

ABTS自由基清除率的测定：精密移取不同浓度的样品溶液各1.00 mL置于10 mL具塞试管中，加入ABTS自由基工作液6.00 mL，混匀，室温静置6 min，用紫外可见分光光度计测定734 nm处吸光度(A1)。用等体积蒸馏水代替样品溶液，同法操作，测定其吸光度(A0)；用等体积蒸馏水代替ABTS自由基工作液，测定其吸光度(A2)；以相同浓度VC溶液作为阳性对照。按式(3)计算ABTS自由基清除率：

(3)

1.4 桑枝提取物的抑菌活性评价

分别称取各提取物100 mg溶于1 mL相应的提取溶剂中，配制成浓度为100 mg·mL-1的样品溶液。将灭菌后的圆形滤纸片(直径6 mm)放入样品溶液中浸泡30 min，取出后放在称量纸上晾干，置于紫外灯下。

采用滤纸片法测量各提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径。用移液枪吸取 200 μL菌液，均匀涂布于培养基表面；用镊子将滤纸片呈四边形形状铺在培养基表面；将培养皿置于37 ℃生化恒温培养箱中培养24 h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，平行测量3次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 桑枝提取物对DPPH自由基的清除率(图1)

图1 桑枝提取物对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH free radicals by Ramulus mori extracts

由图1可知，桑枝提取物对DPPH自由基的清除率随着提取物浓度的增加逐渐升高，其中桑枝水提物对DPPH自由基的清除率升幅较快，而桑枝醇提物的升幅较慢；相同浓度下，桑枝提取物对DPPH自由基的清除率低于VC；在0.4～1.4 mg·mL-1范围内，克拉玛依桑枝水提物对DPPH自由基的清除能力优于桑枝饮片水提物。

2.2 桑枝提取物对羟基自由基的清除率(图2)

图2 桑枝提取物对羟基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of hydroxyl free radicals by Ramulus mori extracts

由图2可知，桑枝提取物对羟基自由基的清除率随着提取物浓度的增加逐渐升高；在0.7～2.0 mg·mL-1范围内，桑枝水提物对羟基自由基的清除率高于VC，其中，克拉玛依桑枝水提物对羟基自由基的清除能力最强，在浓度为1.5 mg·mL-1时，清除率达到70.4%。

2.3 桑枝提取物的还原能力(图3)

图3 桑枝提取物的还原能力Fig.3 Reducing ability of Ramulus mori extracts

由图3可知，桑枝提取物具有一定的还原能力，且随着提取物浓度的增加逐渐增强；相同浓度下，克拉玛依桑枝醇提物的还原能力强于其它3种提取物，但均弱于VC。

2.4 桑枝提取物对ABTS自由基的清除率(图4)

图4 桑枝提取物对ABTS自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS free radicals by Ramulus mori extracts

由图4可知，相同浓度下，桑枝提取物对ABTS自由基的清除率均低于VC；克拉玛依桑枝水提物对ABTS自由基的清除率高于桑枝饮片水提物，克拉玛依桑枝醇提物对ABTS自由基的清除率整体高于桑枝饮片醇提物；当浓度为0.20 mg·mL-1时，克拉玛依桑枝醇提物对ABTS自由基的清除能力与VC接近。

2.5 桑枝提取物的抑菌活性

100 mg·mL-1桑枝提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果如图5所示，抑菌圈直径如表1所示。

a,b,c.大肠杆菌 d,e,f.金黄色葡萄球菌

表1 桑枝提取物的抑菌圈直径/mm

由表1可知，当浓度为100 mg·mL-1时，克拉玛依桑枝提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌活性，抑菌圈直径最小值为7.6 mm，最大值为9.0 mm；克拉玛依桑枝提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性接近或优于桑枝饮片提取物。

3 结论

克拉玛依桑枝提取物对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基均具有较强的清除能力；当浓度为1.5 mg·mL-1时，克拉玛依桑枝水提物对羟基自由基的清除率达到70.4%，清除能力优于VC；当浓度为100 mg·mL-1时，克拉玛依桑枝提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌活性，抑菌圈直径最小值为7.6 mm，最大值为9.0 mm。克拉玛依桑枝提取物的抗氧化活性及抑菌活性接近或优于桑枝饮片提取物，为新疆蚕桑产业的发展提供了理论依据。