电针对AD模型幼鼠学习记忆功能和海马突触可塑性的影响*

张松江，李龙洋，高剑峰

（河南中医药大学医学院，河南郑州 450046）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是与年龄相关的神经退行性疾病，其早期的主要病理变化是皮层和海马部位神经元外的β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉淀（Aβ 老年斑）和神经元内高度磷酸化的tau蛋白形成的纤维缠结［1-2］。研究显示，AD 的病理机制与Aβ 导致的神经元突触可塑性下降有密切关系［3-5］。电针（electroacupuncture，EA）刺激AD 模型动物相关穴位可以有效改善皮层和海马的突触数量、结构和功能［6-8］。目前EA治疗对突触可塑性的研究所用的动物模型基本是成年鼠，缺乏对幼年AD 模型鼠预防性电针刺治疗的突触可塑性机制探索。因此，本研究以6周龄APP/PS1转基因小鼠为AD 模型，EA 刺激“百会”“风府”和双侧“肾俞”，探索EA 刺激穴位对AD 模型幼鼠突触可塑性的影响及其机制。

材料与方法

1 实验动物和分组

SPF级6周龄雄性APP/PS1转基因小鼠24只，体质量20～22 g，自由摄食和饮水，12 h/12 h 明暗交替，环境温度为（24±1）℃，相对湿度55%～65%。将AD模型幼鼠随机分为EA 组（12 只）和AD 模型组（AD组，12 只），另以同月龄的正常C57BL/6J 小鼠作为正常对照组（CO 组，12只）。实验动物均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物使用许可证号：SYXK（豫）2015-0005。本研究经过河南中医药大学伦理委员会审查（伦理编号：DWLL2018030019）。

2 主要仪器和试剂

华佗牌电针仪（型号SDZ-Ⅲ）和华佗牌针刺针（0.25 mm×13 mm）购自苏州医疗用品厂有限公司；StepOnePlus™荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems）；电泳仪、电转仪和蛋白显影仪（Bio-Rad）；冰冻切片机（Leica）；快速Golgi 染色试剂盒（PK401，FD Neuro-Technologies）；RNA 提取液和引物（武汉赛维尔生物科技有限公司）；脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、N-甲基-D-天冬氨酸受体2B 亚 基（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）及突触小泡蛋白（synaptophysin，SYN）单克隆抗体（Immunoway）；其它基础试剂均为国产。

3 电针干预

适应性饲养1 周后，开始对EA 组小鼠进行EA干预治疗。方法同文献［6］：参考《实验针灸学》［9］对小鼠进行穴位定位，于顶骨正中（“百会”）向后斜刺2 mm，枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷中（“风府”）向后下方斜刺2 mm，第2 腰椎后两旁凹陷中（双侧“肾俞”）直刺2 mm。“百会”和左侧“肾俞”为一对正负极，“风府”和右侧“肾俞”为一对正负电极。断续波刺激频率为10 Hz，刺激强度为2 mA。AD组和CO组在同样的时间仅给予同样的抓取和固定。EA 刺激每天1次，每次20 min，每周休息1 d，疗程为16周。

4 检测指标及方法

4.1 Morris 水迷宫检测各组小鼠的学习和记忆功能 水迷宫为直径1.2 m 的圆形水槽，水深25 cm，保持水温22 ℃左右，水槽内壁饰以固定图案，作为标志物。小鼠每天在固定的时间游泳，保持周围环境不变。

4.1.1 定位航行实验 实验时在一个象限内放置直径为8 cm 的平台，平台隐藏于水下1.5 cm。实验训练期为4 d，每天1次，分别从平台之外的三个象限放入水中，每次间隔休息2 min。记录小鼠从不同的象限下水开始到找到水下平台所用的时间，最大时间为120 s，超过120 s 没有找到时，按120 s 计，人工引导小鼠到平台。

4.1.2 空间搜索实验 定位航行实验后，第5 天撤去平台，从一固定入水点将小鼠放入水中，记录小鼠2 min 内在原平台所在象限停留时间及穿越原平台所在位置的次数。

4.2 组织取材 水迷宫实验结束后，各组小鼠用10%水合氯醛（0.3 mg/kg）腹腔注射麻醉，无菌条件下用pH 7.4 的0.9% NaCl 溶液100 mL 对所有小鼠从左心室灌流，冲洗脑组织血液后，每组随机选6只，快速取出左侧海马置于Golgi 染色浸泡液中，进行Golgi染色。每组随机选6只小鼠的左侧海马置于4%多聚甲醛PBS 缓冲液中固定，用于透射电镜检测。在无菌环境下冰上快速取出右侧海马，置于液氮，再置于-80 ℃超低温冰箱，用于mRNA 和蛋白检测。

4.3 Golgi 染色观察海马CA1 区锥体细胞树突结构 取浸泡于Golgi 染色液中的左侧海马组织进行冰冻切片，厚度100 µm，按快速Golgi 染色试剂盒说明书进行染色、封片，并置于高倍显微镜下观察。每组小鼠从同一水平的脑区切片上选取20～30 个神经元进行统计分析。使用Image-Pro Plus 7.0 图像分析软件统计小鼠海马CA1区神经元树突棘数目。

4.4 透射电镜观察海马CA1 区超微结构 左侧海马经含4%多聚甲醛的PBS 固定2 h 后，用0.1 mol/L PBS 漂洗三次；1%四氧化锇（锇酸）后固定1 h；同样漂洗三次；丙酮逐级（50%→70%→90%→100%）脱水；Epon812 环氧树脂包埋剂与100%丙酮1∶1 比例浸泡2～4 h，包埋，切片厚度70 nm；醋酸铀和硝酸铅双重染色；每例观察3 张铜网，每张铜网随机拍摄5张照片。

4.5 实时荧光定量PCR 检测海马区SYN、NR2B 和BDNF 的mRNA 表达水平 每组随机选取6 只小鼠的右侧海马进行组内合并，液氮研磨。用Trizol试剂提取总RNA；进行浓度和纯度验证后，将RNA 反转录为cDNA 并进行PCR 扩增。反应体系（25 µL）包括：2× qPCR Mix 12.5 µL，7.5 µmol/L 引物2.0 µL，反转录产物2.5 µL，ddH2O 8.0 µL。引物序列见表1。扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃15 s→60 ℃60 s，40 次循环；熔解曲线60 ℃→95 ℃，每15 s 升温0.3 ℃。以GAPDH 为内参照，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4.6 Western blot 检测海马区SYN、NR2B 和BDNF的蛋白表达水平 每组随机选取6 只小鼠的右侧海马样本进行组内合并，液氮研磨后用组织裂解液进行蛋白抽提；蛋白浓度测定后进行SDS-PAGE，恒压90 V 电泳30 min，换压至120 V 90 min；转PVDF 膜，用1∶200 抗体稀释液（3%脱脂奶粉的PBST 溶液）稀释Ⅰ抗（BDNF、SYN 和NR2B 和β-actin 抗体），4 ℃孵育过夜；洗涤后用同样稀释液稀释Ⅱ抗，37 ℃摇动孵育1 h；洗涤后在显影仪中用ECL 显影液显影。采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析，以目的蛋白与内参照β-actin灰度的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

5 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。所有数据符合正态分布，方差齐，组间比较用单因素方差分析，重复测量资料采用重复测量的方差分析，两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 Morris水迷宫检测各组小鼠学习和记忆功能

从图1 可以看出，EA 刺激AD 模型幼鼠“百会”、“风府”和双侧“肾俞”16 周后，经过4 d 的水迷宫训练，与CO 组相比，AD 组定位航行实验潜伏期显著延长（P＜0.05），穿越平台次数和平台滞留时间显著缩短（P＜0.05）；与AD组相比，EA组小鼠的定位航行实验潜伏期显著缩短（P＜0.05），穿越平台次数和平台滞留时间显著增加（P＜0.05）。

2 各组小鼠海马CA1区神经元树突棘比较

Golgi染色显示，CO组小鼠海马CA1区神经元树突棘清晰，呈树状，且数目较多；与CO 组比较，AD 组小鼠海马神经元树突棘部分丢失，数目显著减少（P＜0.05）；与AD 组比较，EA 组小鼠海马神经元树突棘数目增多（P＜0.05），见图2。

3 各组小鼠海马CA1区透射电镜结果

与CO 组比较，AD 组小鼠海马CA1 区突触数目减少，前膜活化区和后膜致密带变细，突触末梢内递质小泡数量稀疏，境界不清；与AD 组比较，EA 组可见大量突触，突触前后成分境界清楚，轮廓完整，突触前末梢内突触小泡分布密集均匀，清晰可见，突触后膜致密带变厚、密度增高，活性区变厚、较长，见图3。

4 各组小鼠海马SYN、NR2B 和BDNF 的mRNA 表达水平

实时荧光定量PCR 结果显示，与CO 组相比，AD组小鼠海马BDNF、SYN 和NR2B 的mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01）；与AD 组相比，EA 组小鼠海马BDNF、SYN 和NR2B 的mRNA 表达水 平显著升高（P＜0.01），见图4。

Figure 1.Morris water maze test results of the mice in each group after electroacupuncture（EA）treatment.A：escape latency；B：number of platform crossing；C：time spent in target quadrant.Mean±SD. n=12.*P＜0.05 vs control（CO）group；#P＜0.05 vs AD group.图1 电针治疗后各组小鼠的水迷宫检测结果

Figure 2.Comparison of dendritic structure and number of dendritic spines in hippocampal CA1 region of the mice in each group（Golgi staining，×600）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（CO）group；#P＜0.05 vs AD group.图2 各组小鼠海马CA1区树突结构及树突棘数目比较

Figure 3.Transmission electron microscopy showed synapses in the hippocampus（as indicated by red arrows；scale bar=500 nm）.图3 透射电镜显示海马区突触

5 各组小鼠海马BDNF、SYN和NR2B的蛋白表达

从图5 可以看出，与CO 组相比，AD 组小鼠海马BDNF、SYN 和NR2B 的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与AD 组相比，EA 组小鼠海马BDNF、SYN 和NR2B的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。

讨 论

Figure 4.Relative mRNA levels of BDNF，SYN and NR2B in hippocampal tissues of the mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.01 vs control（CO）group；#P＜0.01 vs AD group.图4 BDNF、SYN和NR2B mRNA表达相对量

Figure 5.Western blot results of BDNF，SYN and NR2B.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（CO）group；#P＜0.05 vs AD group.图5 BDNF、SYN和NR2B的Western blot结果

很多研究证实EA 刺激可以改善AD 病人和模型小鼠的学习和记忆功能［10-12］。本研究的水迷宫检测结果也显示，经过16 周的电针“百会”“风府”和双侧“肾俞”后，与AD 模型小鼠相比，EA 组小鼠的学习和记忆功能明显增强。虽然EA 对其他原因造成的突触损伤和学习记忆障碍有改善作用［13-14］，但是，我们认为EA 对AD 模型小鼠的防治作用具有独特的影响。Aβ 老年斑是AD 的早期特征性病理表现［2］。APP/PS1转基因小鼠在5 月龄（22 周左右）开始出现老年斑。在我们前期的研究中，6周龄APP/PS1转基因AD 模型小鼠经过16 周的继续饲养后，大脑皮层和海马出现大量Aβ 老年斑，而经过16 周的EA 干预组小鼠老年斑数量明显减少，同时学习记忆功能得到明显改善［15-16］。

本研究对海马CA1 区神经元树突Golgi 染色也显示，与CO 组比较，AD 组小鼠海马神经元树突棘部分丢失，数目减少；与AD 组比较，EA 组小鼠海马神经元树突棘数目明显增多。通过透射电镜观察发现，AD 模型小鼠海马区突触数目减少，前膜和后膜结构稀疏不清；经过16 周的EA 刺激“百会”“风府”和双侧“肾俞”后突触结构数目增多，结构清晰。这些结果与王煜［17］等的研究结果是一致的。树突棘是形成突触的重要部位，其数量可随功能而变化，即表现为突触的可塑性改变。突触可塑性是评价学习记忆能力的生物学基础。突触结构和生理功能的改变都可以导致其传递效能的改变［18］。这说明EA 刺激“百会”“风府”和双侧“肾俞”可改善AD 模型小鼠的突触结构，从而改善AD模型小鼠的学习记忆功能。

长时程增强是学习记忆的基础，其分子机制是海马谷氨酸突触后NMDA 受体和AMPA 受体的大量激活，使突触后反应增强［18］。NR2B是NMDA 受体的一个调节亚单位，主要存在于海马和皮层组织中，对学习记忆功能有较强的影响［18-19］。有研究已经证明，AD 模型小鼠海马区NR2B 的表达下降［20］，通过慢病毒载体过表达NR2B 缓解了APP/PS1转基因小鼠的记忆障碍和焦虑抑郁样行为［21］。本研究实时荧光定量PCR 和Western blot 检测结果也显示，与CO 组相比，AD 组小鼠海马NR2B 的mRNA 和蛋白表达水平显著降低；与AD 组相比，EA 组小鼠海马NR2B 的mRNA 和蛋白表达水平显著升高，说明对AD 模型鼠进行16 周的EA 刺激“百会”“风府”和双侧“肾俞”，其学习记忆功能的改善可能与NR2B 增加引起的突触可塑性改善有关。

SYN 是分子量为38 000 的糖蛋白，位于突触前结构的突触囊泡膜上，促进突触小泡的前移和递质的释放，是成熟突触小泡和突触结构的重要标志性蛋白［22-23］。研究表明，SYN表达的增加能够增强大鼠的空间辨别性学习记忆能力［24-25］。Dong 等［26］的研究显示，与野生型大鼠相比，APP/PS1转基因大鼠小脑内SYN 和BDNF/TrkB 的表达降低，突触间隙宽度增加，突触后密度变薄。本研究结果也显示，EA 刺激AD 模型小鼠后，SYN 的mRNA 和蛋白表达增加的同时，海马神经元树突棘数目增多，电镜观察突触小泡增多、结构呈清晰改变。这说明EA 刺激“百会”“风府”和双侧“肾俞”对AD 模型幼鼠学习记忆功能的改善与由SYN引起的海马突触可塑性增强有关。

BDNF 可以诱导轴突和树突末端结构和功能变化［27］。在器官型耳蜗外植体中，BDNF增强了螺旋神经节神经元和内毛细胞之间的突触形成，并在毒素诱导的突触病中恢复了这些连接［28］。de Pins 等［29］的研究显示，在过表达BDNF 的杂交鼠中，BDNF/TrkB下游信号传导活性与树突棘密度和形态的改善相关；与5xFAD 小鼠相比，杂交鼠的突触标志物PSD-95 和突触素也有不同程度的恢复，兴奋性突触的突触前小泡数量也有所增加。本研究结果也显示，EA刺激AD 模型幼鼠的“百会”“风府”和双侧“肾俞”，在电镜观察到突触前活性区和突触后致密带增厚改变的同时，BDNF 的mRNA 和蛋白表达增加，说明电针“百会”“风府”和双侧“肾俞”对AD 模型小鼠学习记忆功能的改善与BDNF 引起的海马突触可塑性改善有关。

总之，本研究结果说明，通过对6 周龄APP/PS1幼鼠进行为期16 周的EA 刺激“百会”“风府”和双侧“肾俞”，明显改善了小鼠的学习记忆功能和突触可塑性。本研究结果将为EA刺激预防和治疗AD 提供研究基础，其信号机制还需进一步研究。